Hsa_circ_0003998调控miR-218-5p/Wnt/β-catenin通路对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

林辉雄 王 琳 周悦乔 刘志强 林川杰

1.琼海市人民医院肿瘤内科 (海南 琼海， 571400) 2.海南省人民医院(海南医学院附属海南医院)肿瘤内科

肝癌是一种全球范围内最常见的恶性肿瘤，具有较高的转移率、复发率和死亡率，预后较差[1，2]。目前，肝切除术、肝移植、放化疗、靶向治疗等多种治疗手段的综合应用，使肝癌的5年生存率得到了一定提高，但其易复发和转移，导致预后仍不太理想[3，4]。肝癌的发生和转移涉及多种基因和信号通路的失调，因此深入探讨肿瘤发生转移的内在分子机制，对探索新的肝癌治疗靶点具有重要意义。

环状RNA(circRNA)是一类呈封闭环状结构的非编码RNA分子，近年来越来越多的证实表明，circRNA在癌症中表达失调，参与癌细胞增殖、凋亡、转移等过程，与癌症进展密切相关[5～7]。Hsa_circ_0003998是一个剪接序列长度为304 nt的circRNA，位于chr20:47570092-47580435，被证实在肝细胞癌中高表达，与肿瘤大小、分化程度、微血管侵犯和患者总生存期有关，提示circ_0003998可能参与肝癌的发生发展[8]。本研究在此基础上，体外培养肝癌细胞，深入研究circ_0003998对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；青链霉素混合液购自北京索莱宝科技有限公司；Lipofectamine 3000转染试剂购自美国ThermoFisher公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；CCK8试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；实验用所有蛋白抗体购自上海艾博抗贸易有限公司。

1.2 细胞培养 人肝上皮细胞THLE-2细胞和肝癌细胞Huh7、MHCC97、Hep3B、PLC/PRF/5均购自美国ATCC。所有细胞均培养于含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素混合液的DMEM培养液，于37℃、5% CO2的无菌细胞培养箱中培养。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞转染及分组 小干扰RNA(siRNA)阴性对照、circ_0003998 siRNA、miRNA inhibitor、miR-218-5p inhibitor由广州锐博生物技术有限公司设计合成。使用Lipofectamine 3000转染试剂，分别将siRNA 阴性对照和circ_0003998 siRNA转染至Huh7细胞，并记为si-NC组和si- circ_0003998组；另将miRNA inhibitor、miR-218-5p inhibitor分别与circ_0003998 siRNA共转染至Huh7细胞，记为si-circ_0003998+anti-NC组和si-circ_0003998+anti-miR-218-5p组。

1.3.2 qRT-PCR实验 收集对数生长期的细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，紫外吸收法进行RNA浓度检测和纯度检测，提取RNA溶液的A260/A280比值在1.8～2.1之间，纯度符合实验要求。取适量RNA样品为模板，进行逆转录反应，合成cDNA。以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应，结果分别以GAPDH和U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算circ_0003998和miR-218-5p的相对表达量。

1.3.3 CCK8实验 收集对数生长期的细胞，调整细胞悬液浓度为5×104/ml，以每孔100 μl接种于96孔细胞培养板中，置于37℃、5% CO2的无菌细胞培养箱中培养。分别于培养24 h、48 h、72 h时，每孔加入10 μl CCK8溶液孵育4 h，使用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值(OD值)。

1.3.4 Transwell实验 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室。取生长至对数期的细胞，消化、洗涤，用无血清培养液重悬，调整细胞浓度为2×105/ml。细胞迁移检测：在下室加入800 μl含血清培养液，上室中加入150 μl细胞悬液，置于细胞培养箱中培养24 h；取出上室，吸除上室内液体，将上室放入加有800 μl甲醇的培养孔中，室温固定30 min；取出上室，吸干上室固定液，将上室放入加有800 μlGiemse染色液的培养孔中，室温染色20 min；取出上室，冲洗，用湿棉棒轻轻擦去上室底部膜表面的细胞，晾干，移至载玻片上，封片，显微镜下计数5个随机视野，统计细胞迁移数目。细胞侵袭检测：用无血清培养液稀释Matrigel基质胶(5∶1)，在上室中加入100 μl Matrigel基质胶，待胶凝固后，每孔加入100 μl细胞悬液，同时在下室中加入500 μl含血清培养液，置于培养箱中孵育24 h，取出上室，冲洗后，用5%戊二醇固定，然后加入Giemsa染色10 min，冲洗，显微镜下观察并计数细胞侵袭数目。

1.3.5 双荧光素酶实验 本研究通过circBank网站分析发现circ_0003998与miR-218-5p具有结合位点。将含有miR-218-5p结合位点的circ_0003998的序列构建双荧光素酶报告载体，记为circ_0003998 WT，将含有miR-218-5p结合位点的circ_0003998序列突变，构建双荧光素酶报告载体，记为circ_0003998 MUT，将circ_0003998 WT和circ_0003998 MUT分别与miRNA mimics(miR-NC)、miR-218-5p mimics(miR-218-5p)共转染Huh7细胞，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.3.6 Western blot实验 收集对数生长期的细胞，使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白样品的蛋白浓度，将蛋白样品在沸水中加入3～5 min，充分变性，然后进行SDS-PAGE电泳分离目的蛋白，转膜，封膜。加入稀释后的一抗β-catenin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶500)、E-cadherin(1∶500)、GAPDH(1∶2 500)，4℃孵育过夜，洗膜，加入辣根过氧化酶标记的二抗稀释液(1∶1 000)，室温孵育1 h。洗膜，加入显色液显色，显微镜下曝光、拍照，使用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.4 统计学方法 本研究所有实验均进行3次生物学重复，实验数据应用统计学软件SPSS19.0分析，以均数±标准差表示，两组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌细胞中circ_0003998、miR-218-5p的表达 qRT-PCR实验结果，与人肝上皮细胞THLE-2细胞相比，肝癌细胞Huh7、MHCC97、Hep3B和PLC/PRF/5中circ_0003998相对表达量明显升高(P<0.05)，miR-218-5p相对表达量明显降低(P<0.05)，其中Huh7细胞中circ_0003998和miR-218-5p差异表达最明显。见表1。

2.2 敲减circ_0003998抑制肝癌Huh7细胞增殖 见表2。

2.3 敲减circ_0003998抑制肝癌Huh7细胞迁移和侵袭 Transwell实验结果，与si-NC组比较，si-circ0003998组细胞迁移数目和细胞侵袭数目均明显减少(P<0.05)。见图1和表3。说明敲减circ0003998能抑制Huh7细胞迁移和侵袭。

表1 circ_0003998、miR-218-5p在肝癌细胞中的表达

表2 细胞增殖检测

组别细胞迁移数目细胞侵袭数目si-NC组97.63±11.2455.57±7.05si-circ0003998组36.58±4.74*18.69±2.14*

2.4 circ_0003998靶向miR-218-5p 本研究通过circBank网站分析发现circ_0003998与miR-218-5p具有结合位点(见表4)；双荧光素酶实验结果(见表5)，与circ_0003998 wt和miR-NC共转染组比较， circ_0003998 wt和miR-218-5p共转染组的细胞中荧光素酶活性明显降低(P<0.05)；qRT-PCR实验结果(见表6)，与si-NC组比较，si-circ0003998组细胞中miR-218-5p相对表达量明显升高(P<0.05)。说明Huh7细胞中circ0003998靶向负调控miR-218-5p的表达，敲减circ0003998上调miR-218-5p的表达。

表4 circ_0003998与miR-218-5p的结合位点

表5 荧光素酶活性检测

表6 circ0003998负调控miR-218-5p的表达

2.5 抑制miR-218-5p逆转circ_0003998的作用 见表7、表8。

表7 细胞增殖检测

表8 细胞迁移和侵袭数目比较

2.6 circ_0003998/miR-218-5p对Wnt/β-catenin通路和EMT通路蛋白表达的影响 见表9、图2。Western blot实验结果，与si-NC组比较，si-circ0003998组细胞中β-catenin、N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达明显降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白相对表达明显升高(P<0.05)；与si-circ0003998+anti-NC组比较，si-circ0003998+anti-miR-218-5p组细胞中β-catenin、N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达明显升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白相对表达明显降低(P<0.05)。说明敲减circ_0003998抑制Huh7细胞中Wnt/β-catenin通路活性，抑制EMT，而抑制miR-218-5p能够逆转这种作用。

表9 蛋白相对表达量比较

图2 Western blot检测蛋白表达

3 讨论

近年来研究发现，circRNA异常表达参与肿瘤发生和发展，可作为肿瘤潜在的生物标志物，也可能为肿瘤靶向治疗提供新的靶点[9]。如circ_0001649在肝癌组织中低表达，与肿瘤大小和复发有关，分析癌组织和癌旁组织表达发现，circ_0001649对肝癌具有一定诊断价值[10]。circ_103809在肝癌中高表达，体外实验证实敲除circ_103809抑制肝癌细胞增殖、周期进展和迁移，体内实验证实circ_103809的短发夹RNA发挥肿瘤抑制作用[11]。circ_0003998被报道是肝癌的独立预后因子，且与乙型肝炎和健康者比较，其诊断肝癌的曲线下面积(AUC)为0.833，对肝癌具有较高的诊断价值[8]。此外，circ_0003998在非小细胞肺癌中高表达，可靶向miR-326促进癌细胞增殖、侵袭和化疗耐药[12，13]。

本研究结果，circ_0003998在肝癌细胞中高表达，体外构建敲低circ_0003998表达的Huh7细胞，发现敲除circ_0003998后细胞增殖、迁移和侵袭能力受到抑制。功能实验研究表明[14，15]，circRNA在细胞中主要是作为miRNA的海绵起作用。本研究通过生物信息学网站circBank发现，circ_0003998与miR-218-5p具有结合位点，双荧光素报告基因实验和qRT-PCR实验证实circ_0003998靶向负调控miR-218-5p的表达。进一步在Huh7细胞中抑制miR-218-5p进行回复实验，发现抑制miR-218-5p逆转了敲除circ_0003998对Huh7细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。提示circ_0003998通过靶向miR-218-5p调控肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。

Wnt/β-catenin通路是经典的Wnt信号通路，Wnt活化后首先与细胞膜上的跨膜受体结合，将Wnt信号传递至胞质蛋白，经过一系列复杂反应使胞质内β-catenin水平增高，进而β-catenin发生核转移，与核内转录因子结合激活下游靶基因，其异常活化与恶性肿瘤发生密切相关[16-18]。EMT是由上皮细胞转化成间质细胞并获得迁移和侵袭能力的过程，研究表明， Wnt/β-catenin通路活化可诱导EMT发生从而促进肿瘤细胞生长和转移[19]。本研究分析Huh7细胞中β-catenin蛋白及EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin和E-cadherin的表达发现，敲减circ_0003998后Huh7细胞中β-catenin和N-cadherin、Vimentin蛋白表达减少，而E-cadherin表达增多，说明敲减circ_0003998抑制了细胞中Wnt/β-catenin通路活性和EMT发生，miR-218-5p的回复实验证实，抑制miR-218-5p后逆转了敲减circ_0003998对细胞中Wnt/β-catenin通路活性和EMT发生的作用。

综上所述，circ_0003998在肝癌细胞中高表达，敲减circ_0003998可通过上调miR-218-5p，抑制肝癌细胞中Wnt/β-catenin通路活性和EMT，抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。本研究揭示了circ_0003998对肝癌细胞恶性生物学行为的影响，但其在体内是否抑制肿瘤生长还有待进一步实验研究。