活血祛湿药对糖尿病性脂肪肝大鼠肠道菌群的影响*

徐定昌 羌 瑞 赵 莹 许松云 时歆未 王雨秾△

1.上海中医药大学方剂学教研室 (上海， 201203) 2.上海中医药大学数理教研室

在肝脏疾病中，非酒精性脂肪肝(NAFLD)的发病在我国位居第二，NAFLD常合并有肥胖、高脂血症、糖尿病等[1]。糖尿病合并脂肪肝的发病一般和胰岛素抵抗有关[2]，脂肪组织胰岛素抵抗会加重脂代谢异常[3]。近来有研究显示肠道菌群及其代谢产物与糖代谢和脂代谢关系密切，其中厚壁菌门和拟杆菌门占绝大多数[4]。肠道菌群可与人体共同或单独代谢中药成分，中药成分亦可以调节肠道菌群的平衡[5]。目前活血祛湿药对肠道菌群的影响情况及其与机体代谢产物的关联性并不清楚。本文通过对活血药和祛湿药分组实验，以期明确活血祛湿药对糖尿病性脂肪肝大鼠肠道菌群的影响和相关代谢产物的变化情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6周龄清洁级雄性Wistar大鼠60只，体重140～160 g，于维通利华公司购买，饲养于上海中医药大学实验动物中心〔实验动物使用许可证号：SYXK(沪)2014-0008〕，通过实验动物福利与伦理审查(伦理编号：PZSHUTCM190614013)，自由进食饮水，12 h明暗交替照明，适应性普通饲料喂养1周。

1.2 药物制备 丹参、荷叶各0.3 kg，土茯苓、徐长卿、绞股蓝各0.7 kg，蜜麸炒苍术0.2 kg，以上药物均由上海康桥中药饮片公司提供(批号分别为：180807、180615、180825、180516、180804、180906)。将中药分为活血药(丹参、荷叶、绞股蓝)、祛湿药(土茯苓、徐长卿、炒苍术)、全方药(丹参、荷叶、绞股蓝、土茯苓、徐长卿、炒苍术)，制作水煎液。盐酸二甲双胍片，北京京丰制药集团生产(批号：180133，规格：0.25 g/片)。

1.3 仪器与试剂 荧光定量PCR仪(FTC-3000，美国安捷伦公司)，全自动生化仪(AU5800，贝克曼公司)，血糖仪(卓越金采，批号：200637，罗氏公司)，血糖试纸(批号：476746，罗氏公司)。链脲佐菌素(STZ)于Sigma公司购买(批号：WXBC6558V，规格：1 g，纯度：98%)。

1.4 分组与造模 60只大鼠随机平均分为6组(空白组、模型组、对照组、活血组、祛湿组、全方组)。除空白组大鼠外，其余5组大鼠均行糖尿病性脂肪肝造模：通过两次腹腔注射较低剂量1%STZ溶液，诱导大鼠形成2型糖尿病。配置1%STZ溶液，依照体重计算注射量，腹腔注射，终浓度为30 mg/kg。于STZ注射后的第6天第2次给药，并隔天取大鼠尾尖血检测血糖。血糖大于16.7 mmol/L表明造模成功。

1.5 给药方法 对照组大鼠给予二甲双胍粉末混悬液灌胃，给药量为6.67 ml/kg·d，给药浓度为7.5 mg/ml。分别制备为浓度0.35、0.40、0.75 g/ml的活血药、祛湿药、活血祛湿药水煎液，分别按9.43、9.75、4.40 ml/(kg·d)剂量给活血组、袪湿组、全方组大鼠灌胃，持续7周。

1.6 观察指标 观察大鼠行为、状态及死亡情况；称量体重；观察肝脏形态；第48天，将大鼠置于代谢笼中，收集粪便，于-80℃冰箱保存，待GC-MS检测肠道菌群及短链脂肪酸；第49天，取腹主动脉血。

1.7 各项指标检测 ①采用贝克曼AU5800全自动生化仪检测天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。②实时PCR定量检测厚壁菌、拟杆菌：采用QIAamp DNA Stool Mini Kit 对样本进行基因组抽提，提取质粒用Axygen plasmid miniprep Kit(Axygen公司)试剂盒，测定质粒浓度用Qubit 3.0(Life Biotech公司)。通过荧光定量方法对厚壁菌与拟杆菌进行定量检测。所用引物及引物序列：厚壁菌928-Firm TGAAACTYAAAGGAATTGACG；1040FirmR ACCATGCACCACCTGTC。拟杆菌798cfbF CRAACAGGATTAGATACCCT；cfb967R GGTAAGGTTCCTCGCGTAT。qPCR反应采用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Takara公司)。③GC-MS定量检测短链脂肪酸实验：取粪便100 mg，加100 μl 15%磷酸，再加50 μg/ml 的内标(异己酸)溶液100 μl和乙醚400 μl匀浆1 min，于4 ℃ 12 000 rpm 离心10 min，取上清液上机测试。GC-MS 检测的顶空条件、气相色谱条件、质谱条件等参数参照参考文献[6]。

2 结果

2.1 各组大鼠体重情况 见图1。在造模的第12天到第26天，全方组大鼠与模型组、对照组相比，体重增长速度显著下降，差异有统计学意义(P=0.017、0.025)。

图1 各组大鼠体重图

2.2 各组大鼠生化指标检测结果 见图2。全方组大鼠ALT水平高于空白组大鼠，P=0.004；活血组大鼠AST水平高于空白组、模型组和对照组，P<0.05；全方组大鼠TG水平低于对照组，P=0.014 ；造模后各组大鼠TC与LDL水平均升高，P<0.05；全方组大鼠HDL水平较其余各组升高，且与祛湿组相比，差异具有统计学意义，P=0.045。

2.3 各组大鼠肠道菌群丰度检测结果 对照组大鼠拟杆菌含量低于模型组大鼠，P=0.029；祛湿组大鼠拟杆菌含量高于对照组大鼠，P=0.014。各组厚壁菌含量无显著差异，P>0.05。

2.4 各组大鼠菌群丰度与代谢产物及生化指标的相关性 见图4。空白组大鼠中两种肠道菌与异戊酸都呈负相关(r<0,P<0.01)，与乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、己酸呈正相关(r>0,P<0.01)。模型组大鼠TC与HDL和LDL均呈正相关(r值分别为0.736和0.967,P<0.05)；厚壁菌与乙酸、丙酸、丁酸、戊酸呈负相关(r<0,P<0.01)，与异丁酸、异戊酸、己酸呈正相关(r>0,P<0.01)；拟杆菌与厚壁菌呈负相关(r=-0.949,P<0.01)。对照组大鼠两种肠道菌与各短链脂肪酸呈正相关(r>0,P<0.01)，TC与两种肠道菌及LDL均呈正相关(r>0,P<0.01)。

图2 各组大鼠生化指标检测结果(n=10)

图3 各组大鼠肠道菌群丰度检测结果(n=6)

图4 各组大鼠菌群丰度与代谢产物及生化指标的相关性

3 讨论

Hernández等[7]研究表明，结肠内代谢发酵的醋酸，对体重控制和体内乳糖稳态以及胰岛素敏感性有较好的促进作用，丙酸是拟杆菌门发酵的主要产物，吸收后主要由肝脏代谢，并抑制胆固醇的合成[8]。丁酸可改善高脂饮食引起的体脂率升高和胰岛素抵抗[9]。肥胖小鼠拟杆菌门数量减少，厚壁菌门数量增加[10]。这些研究表明肠道菌群和短链脂肪酸之间、短链脂肪酸和脂代谢之间存在密切联系。因此我们测定了各组大鼠血清指标及肠道菌群丰度并进行相关性分析，实验结果中模型组大鼠血清TC与LDL浓度升高，且两种肠道菌与各短链脂肪酸相关性分布较空白组发生变化，表明造模使其短链脂肪酸及脂质代谢发生了异常。对照组大鼠两种肠道菌与各短链脂肪酸的相关性分布接近空白组，且与TC表现出正相关。这与我们推测相符，提示药物对于糖尿病性脂肪肝的改善作用可能通过改变拟杆菌和厚壁菌与短链脂肪酸的代谢关系从而影响TC代谢，达到治疗目的。但这种通路的靶点位置有待进一步研究。

糖尿病性脂肪肝在中医学中散见于“消渴”“积聚”“肝着”“脾瘅”等病证中[11]。临床多见患者属痰瘀互结证、痰湿内阻证、肝郁气滞证等证型[12]。其病机为脾胃运化失常，水湿内停，痰湿气阻，湿阻气机，日久阻碍血行，瘀在胁肋，形成本虚标实之证[13]。《素问·奇病论》中提到“治之以兰，除陈气也”为脾瘅的治疗原则，即可以使用芳香化湿、健脾化湿、清利湿热之品[14]。临床上常用丹参、荷叶、绞股蓝活血化瘀，其中荷叶、绞股蓝对肥胖症、高脂血症具有良好的预防和治疗的

作用[15]。刘君颖等[16]研究表明化痰祛湿活血方具有减轻肝细胞脂肪沉积的作用。苍术、徐长卿、土茯苓祛湿，柴胡、郁金、决明子、砂仁疏肝健脾。为明确活血祛湿中药对糖尿病性脂肪肝大鼠肠道菌群的影响。我们测定了各组大鼠拟杆菌和厚壁菌丰度并进行比较，结果表明祛湿组大鼠拟杆菌丰度明显高于对照组，而厚壁菌在各组大鼠间无明显差异；全方组大鼠TG水平低于对照组；第2周至第4周全方组与对照组相比，体重增长速度显著下降。提示活血祛湿药在提高拟杆菌丰度及降低TG含量上优于二甲双胍，这对于中药联合西药治疗糖尿病性脂肪肝，有较好的发掘前景。