鸟苷酸结合蛋白α亚基变异与腹膜假黏液瘤关系的研究进展*

徐大钊 林育林 李雁②

鸟苷酸结合蛋白（guanine nucleotide-binding protein，G protein，G蛋白），是哺乳动物细胞信号通路的关键调控因子［1］，哺乳动物细胞绝大多数受体通过与G蛋白偶联而将信号转导至胞内。G蛋白由α、β、γ 3个亚基组成异源三聚体，信号转导依赖于Gα在静止构象（结合二磷酸鸟苷，guanosine diphosphate，GDP）与活化构象（结合三磷酸鸟苷，guanosine triphosphate，GTP）之间的循环交替［2］。与β、γ亚基相比，α亚基具有催化和结合位点，当胞外信号分子与G蛋白偶联受体（G proteincoupled receptor，GPCR）结合时，后者发生构象变化，催化Gα蛋白上GDP置换成GTP，促进Gα活化，提高与下游效应分子的亲和力，同时减少与Gβ、Gγ的亲和力［3］。Gα亚基蛋白（Gα）是G蛋白异源三聚体的结构核心和功能核心，是G蛋白转导信号通路的中枢。深入研究Gα基因表达与调控，对认识该信号转导蛋白的表达和功能机制，探索该基因突变与疾病的相关性，寻找临床治疗的新靶点等，均具有重要意义。本文首先简述Gα蛋白基因表达，重点综述Gα蛋白结构和功能变异与腹膜假黏液瘤（pseudomyxoma peritonei，PMP）中的关系，以期探索腹膜假黏液瘤发病的分子病理学机制。

1 Gα基因转录表达

1.1 GNAS基因生物学特征

Gα 基因（guanine nucleotide-binding protein alpha-subunit，GNAS）位于染色体20q13.32，又称GNAS复合体基因位点（GNAS complex locus），碱基对总长度71 495 bp，包括13 个外显子和12 个内含子，主要编码激动型Gα蛋白（stimulatory G protein α-subunit，Gsα）及其同源异构体，属于G蛋白偶联受体家族。

1.2 GNAS基因的转录和表达

GNAS编码Gα的启动子位于最下游，呈双亲源性等位基因表达。外显子1上游45 kb、35 kb和2.5 kb处有3个选择性启动子，对应3个第一外显子，分别启动转录神经内分泌蛋白55（neuroendocrine secretory protein 55，NESP55）mRNA、超大α蛋白（extra-large alphas protein，XLαs）mRNA 和外显子A/B mRNA，其中外显子A/B mRNA为非翻译性mRNA；在上游启动子调节下，这3个第一外显子与外显子2～13拼接产生不同的转录本（图1），故这些转录产物被称为同源异构体［4］。上述选择性启动子表现出不同的转录表达模式：NESP55由母源等位基因专一性表达，启动子在父源等位基因中甲基化；NESP55 下游有一个反义转录子（反义NESP，NESPantisense，AS），其和XLαs、外显子A/B均由父源等位基因专一性表达，启动子在母源等位基因中甲基化（图1）。

2 Gα蛋白结构与功能

2.1 Gα蛋白结构

GNAS 基因编码Gα 蛋白，由α 螺旋、β 折叠和无规卷曲按下列方式连接：β1→α1→αA→αB→αC→αD→αE→αF→β2→β3→α2→β4→α3→β5→αG→α4→β6→α5（图2A）。包括2 个结构域（图2B）：1）GTP/GDP 结合域（GTP 酶结合域，GTPase domain），通过由第39～394 位氨基酸折叠成5 个α 螺旋（α1～α 5）围绕着6 个β 折叠（β1～β6）所组成，其中6 个β 折叠中除了β2 为反向平行排列，其余β 折叠均为正向平行排列，GTP/GDP 结合域除了具有结合鸟苷酸位点之外，还具有结合β、γ亚基以及偶联受体和效应器的位点；2）螺旋结构域（helical domain），由6个α螺旋（αA～αF）组成，形似“盖子”覆盖在GTP/GDP结合域上［5］，其功能是阻滞GDP 与非活化状态Gα 解聚，对GDP与GTP内在转换效率起限速作用［2］。

Gα 蛋白包含5 个模体（图2C）：G1（第42～55 位氨基酸），G2（第196～204 位氨基酸），G3（第219～228 位氨基酸），G4（第288～295 位氨基酸），G5（第364～369位氨基酸）。Gα有4个GTP/GDP结合域，分别位于第47～55位、第197～204位、第223～227位、第292～295位氨基酸；1个通过酰胺基结合GTP的结合位点，位于第366 位氨基酸。Gα 中4 个GTP/GDP结合域和1个GTP结合位点，分别对应模体G1～G5，故模体是Gα的功能和结构中心。

图1 GNAS基因复合体同源等位基因表达模式

图2 Gα蛋白三维空间构象及5个模体结构域

2.2 Gα蛋白介导细胞信号转导功能

通过7次跨膜的G蛋白循环，G蛋白偶联受体完成细胞信号传导，主要过程如下：1）配体激活偶联的受体后与Gα蛋白结合，导致G蛋白的构象改变，Gα蛋白与GDP亲和力下降，释放GDP，并随即与GTP结合；2）Gα蛋白结合GTP后，与β、γ亚基解聚，成为活化态Gα蛋白，激活下游的效应分子，介导细胞信号通路的转导；3）由Gα蛋白激活的效应分子，反过来同时激活Gα蛋白自身的GTP酶活性，后者将GTP水解成GDP，导致Gα蛋白与效应分子解聚，Gα蛋白恢复至原来构象，重新与β、γ亚基结合形成三聚体，回到静止状态。活化的Gα（Gsα）蛋白通过激活下游的腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC），催化三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）脱去一个焦磷酸分子而生成第二信使环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），介导cAMP/PKA细胞信号传导通路［6］。

2.3 Gα蛋白介导细胞信号转导的分子生物学机制

2.3.1 Gα 蛋白介导cAMP-PKA 信号通路 Gα 蛋白介导cAMP-PKA 信号通路活化的Gα 蛋白首先激活AC，产生第二信使cAMP，并能调节cAMP 表达水平，后者激活cAMP 依赖的蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），PKA 再激活cAMP 效应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）/转录激活因子（activating transcription factor，ATF）等基因调控蛋白，调控基因转录，构成完整的cAMP-PKA 信号转导通路（图3）。激活的CREB/ATF分子可与胞核内的黏蛋白基因的顺式作用元件结合，调节黏蛋白分泌。研究证实PKA抑制剂［7］、异源三聚体G蛋白复合物抑制剂［8］均可抑制黏蛋白分泌。

2.3.2 Gα蛋白介导磷脂酰肌醇信号通路 Gα蛋白介导磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol）信号转导通路（图3），主要过程如下：配体结合G蛋白偶联受体后，导致后者构象改变，活化的Gα蛋白激活下游PLC，PLC催化磷脂形成二酰甘油（diacylglycerol，DAG）和三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3），IP3会导致细胞内Ca2+浓度升高。研究发现Ca2+依赖性蛋白激酶Cε（PKC-epsilon，PKCε，）可上调黏蛋白2（mucin2，MUC2）、黏蛋白5AC（mucin5AC，MUC5AC）的表达［9］；DAG则会直接激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），导致PKC磷酸化［10］，PKC可激活Raf-1，发挥与cAMP-PKA的协同作用［11］。

2.3.3 Gα 蛋白介导其他信号通路 与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路和大鼠肉瘤蛋白（RAS）-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路交叉，通过ATF/CREB、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κb）入核，调节黏蛋白基因表达，间接调节黏蛋白的分泌［11］；PI3K-Akt 信号通路激活的磷酸二酯酶4B（phosphodiesterases 4B，PDE4B）可清除cAMP，拮抗cAMP-PKA信号通路［12］。

图3 Gα蛋白介导细胞信号通路模式图

3 GNAS和Gα蛋白突变与PMP的关系

3.1 GNAS突变与PMP的关系

PMP是一种以黏蛋白持续分泌为主要病理特征的恶性肿瘤综合征。尽管目前无PMP基因突变谱的大样本数据，但多项研究表明，PMP患者中GNAS为高频基因突变［13］，Sio等［14］研究40例PMP肿瘤组织样本，通过高通量测序（next generation sequencing，NGS）发现GNAS突变率为52%；Matson等［15］研究10例PMP患者，检测了石蜡包埋切片中236个癌相关基因，其中4例患者出现GNAS突变（R201H/R201C转换）。有研究发现PMP中存在BRAF基因突变［16］，通过NGS测序发现PMP中高频突变的仍是GNAS和KARS基因，很少有BRAF-V600E、PIK3CA和APC基因突变［17］。因此GNAS基因突变是PMP发生的重要分子机制之一［11］。

GNAS基因突变已在多种恶性肿瘤研究中得到证实［18］，尤其是来源于外分泌和内分泌器官的黏液性肿瘤，如结直肠黏液性癌和阑尾黏液性癌，可高频出现GNAS基因突变，提示该基因的致癌和致分泌作用［19］。

PMP中GNAS突变位点相对稳定，通常为Chr20：57484420（碱基：C-G）和Chr20：57484421（碱基：GC）［11］。PMP 的发生、发展与诸多细胞信号转导通路相关，如PI3K、Akt［20］以及前列腺素EP4 受体（prostaglandin E2 receptor 4，EP4）/cAMP/PKA/CREB等［19］，但PKA 途径是黏蛋白持续分泌的主要参与者，是PMP病理特征的主要因素，抑制PKA 途径会减少大多数PMP 患者的黏蛋白产生［21］。典型的GNAS 突变导致Gα蛋白GTP酶活性降低，GTP不能水解释放磷酸，使GTP 与Gα 蛋白持续结合，后者激活cAMP-PKACREB 信号传导通路，CREB 结合MUC2 启动子，上调MUC2 基因表达，最终导致黏液分泌持续亢进，是PMP发生、发展的核心分子病理机制，该机制也提供了以cAMP/PKA 信号通路为分子靶点治疗PMP 的理论依据［19］。

3.2 Gα蛋白变异与PMP的关系

Gα 蛋白变异与PMP 密切相关，其机制与Gα 蛋白变异后持续激活cAMP-PKA 信号转导通路相关。PMP 中最常见 的Gα 蛋 白变异位点是R201H 或R201C。Gα蛋白R201变异还可见于胰腺癌、卵巢癌和乳腺黏液腺癌［22］。

GNAS 突变作为PMP 分子病理机制已得到研究证实。作为GNAS 突变后的关键蛋白，Gα 形态与功能将成为今后研究PMP的重要内容，包括GNAS-Gα变异与PMP病理特征，预后生存的相关性研究。Noguchi 等［23］在18 例PMP 患者中发现5 例低级别PMP患者存在GNAS突变，而仅在3例高级别PMP中发现GNAS 突变；Alakus 等［12］也发现GNAS 在高级别PMP患者中的突变率较低，而在低级别PMP 存在高频的GNAS突变。预后方面，一项阑尾肿瘤预后的研究［24］认为GNAS 突变的阑尾肿瘤患者的中位生存期达到115.5 个月。但上述报道均为小样本的回顾性研究，有待大样本临床数据的进一步验证。

3.3 PMP中Gα蛋白的突变结构

本研究根据筛查出的GNAS基因突变后Gα蛋白的突变位点R201H 或R201C，利用化学分子式构建突变前后Gα 蛋白的化学基团。根据化学基团的化学特性和化合键变化来判断Gα 蛋白突变的结构和功能。在R201H突变中，第201位的精氨酸突变成组氨酸，组氨酸的分子结构中具有一个苯环结构，含有苯环的化合物具有不易氧化、碳环异常稳定的特性。在R201C突变中，第201位的精氨酸突变成半胱氨酸，其与第200 位的半胱氨酸形成了2 个毗邻巯基，两者构成二硫键，具有稳定蛋白质构象的功能。因此，不论是R201H 还是R201C，突变后的Gα·GTP复合体化学结构更加稳定，使GTP更不易被解聚。

根据Gα蛋白一级结构（UniProtKB数据库提供）及筛查出的Gα蛋白突变位点R201H或R201C，利用Swiss-PDB Viewer 4.1.0软件构建出突变前后Gα蛋白的三维空间结构来判断突变后Gα蛋白的功能变化（图4）。

模体1～5（G1～G5）为Gα蛋白与GTP结合的功能结构域，该结合过程必须有Mg2+螯合参与，Mg2+是Gα酶促结合反应的关键辅基，Mg2+的空间位置和浓度是该结合反应的关键限速因素。正常Gα蛋白三维空间构象中，G1～G5空间构象为紧密异构体，Mg2+完全包埋于G1～G5 模体组成的空间结构中，Mg2+位置限制了Gα 蛋白与GTP的结合效率（图4A）；而R201H构象中G1～G5空间构象特征为疏松异构体，Mg2+全暴露于模体G1～G5功能结构域表面，与H201氨基酸形成平面结构，因此Gα蛋白与GTP结合效率增加，Mg2+能保持Gα·GTP复合体结构的稳定，使GTP不易解聚，研究证实如果不存在Mg2+，则Gα 解聚GTP 效率至少会增加10 倍（图4B）。在R201C构象中G1～G5空间构象特征也为疏松异构体，Mg2+半暴露于G1～G5模体组成的空间结构中，与C201氨基酸形成近似平面结构，也会促进Gα与GTP结合速率，并保持Gα·GTP复合体构象的稳定，使GTP不易解聚（图4C）。

通过Gα蛋白突变前后不同的的三维构象图谱，Mg2+空间位置对Gα蛋白与GTP结合效率起重要作用。Mg2+的空间位置若完全包埋于G1～G5空间构象中，Gα蛋白与GTP结合为正常速率，相应的cAMP为正常水平；Mg2+半暴露于G1～G5空间构象中则有限加速Gα蛋白与GTP的结合速率，cAMP水平相对升高；Mg2+完全暴露于G1～G5空间构象中，无限加速Gα与GTP的结合速率，cAMP水平大幅升高（表1）。

图4 Gα突变前后的三维构象图

表1 Gα蛋白突变前后的三维空间构象及功能变化

4 结语

PMP 相关的Gα 蛋白结构、功能的研究正处于探索起步阶段。GNAS-Gα变异的探索有可能带来PMP诊疗领域的新突破。明确PMP 中Gα 蛋白突变的关键分子特征，将有助于发展针对PMP 的治疗新靶点［24］。目前通过NGS检测PMP患者的高频突变基因的技术已经较为成熟和规范，下一步的研究重点将集中在GNAS突变后Gα蛋白的定性与定量研究以及Gα蛋白表达水平与临床病理特征的关系研究。确保从GNAS 基因转录水平、Gα 蛋白翻译水平以及细胞信号转导功能方面形成完整的PMP分子病理机制的闭环研究。但PMP中细胞较少，富含大量黏液，目前缺乏从富含黏液间质的PMP肿瘤组织中提取富集突变Gα 蛋白的关键技术，是在PMP 中研究Gα 蛋白变异的最大挑战。