江西中部地区孕妇携带的B族链球菌血清型分布

覃德明，肖艳萍，曹星卫，胡龙华

（1.江西省妇幼保健院检验科；2.南昌大学第二附属医院检验科，江西 南昌 330006）

B 族链球菌 （Group B Streptococcus，GBS），为革兰阳性球菌，成双或短链排列，常定植于女性生殖道和胃肠道，为条件致病菌。携带GBS 的孕妇一般无临床症状，少数可引起绒毛膜羊膜炎、胎膜早破和产褥热等疾病[1,2]。但令人担忧的是，有研究报道,携带GBS 的孕妇在分娩时，可经产道致6.3%[3,4]新生儿感染，引起新生儿肺炎、败血症和脑膜炎，甚至死亡等。分泌多种毒力因子是GBS 的主要致病因素，其中最主要的毒力因子是荚膜多糖（capsular polysaccharide,CPS）, 依据 CPS 型特异性将GBS 分为（Ia-IX）10 个血清型[5,6]。携带的 GBS 血清型与孕妇种族、地域和疾病类型相关。孕妇产前常规GBS 筛查，并采用抗生素预防，是目前预防母婴GBS 感染的主要方法,但可能引起细菌耐药和过敏反应，且并不能彻底清除GBS。理想预防GBS 的方法是疫苗[7]，血清分型是疫苗研制的基础。为了解本地区孕妇携带GBS 情况, 对10145 例住院孕妇进行了GBS 筛查及其CPS 血清型分析, 现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 标本及菌株 采集2019 年6 月-11 月江西省妇幼保健院住院孕妇的生殖道分泌物样本，共10145 例。进行常规分离培养，共检出149 株GBS,检出率为1.47%； 随机选取94 例孕妇携带的GBS进行血清型分型。孕妇年龄20~42 岁，平均29.41±3.25 岁；孕周为 17~41 周；初产妇 50 例（53%），经产妇 44 例（47%）。

1.2 仪器与试剂 一次性拭子（扬州市创新医疗器械厂）；哥伦比亚培养基（奥赛飞世尔生物化学制品有限公司）； 美国热电CO2温箱； 法国梅里埃VITEK 2 COMPACT 全自动微生物鉴定系统和配套GP 鉴定卡、AST-GP67 药敏卡；北京全式金公司DNA 提取试剂盒(EasyPureRBacteria Genomic DNA Kit)和 PCR 反应体系(2X TRANSsTartRFastPfu PCR Super Mix)； 赛默飞世尔公司VeritiTMDx 96-Well Thermal Cycler PCR 仪；北京市六一 DYY-6C 型电泳仪； 北京擎科生物科技有限公司杭州分公司合成引物； 珠海黑马医学仪器有限公司紫外投射分析仪；北京擎科生物科技有限100bp DNA Ladder。

1.3 菌株分离与鉴定 取孕妇生殖道分泌物，在2h内送检。标本接种于哥伦比亚血琼脂平板，分区划线后将平板放置于 5%CO2温箱，35℃培养 18~24h。挑取可疑菌落做革兰染色和触酶试验进行初筛，使用VITEK 2 Compact 进行菌株鉴定和药敏实验，同时做CAMP 试验。

1.4 菌株DNA 提取、PCR 扩增和产物分析

1.4.1 DNA 提取 将收集的菌株复苏，转种于哥伦比亚血平板，挑取3~5 个菌落接种于装有3ml 脑心浸液（BHI）琼脂肉汤试管,35℃、振摇 18~24h,取1ml 混悬液于 1.5mlEP 管，按 DNA 提取试剂盒步骤提取DNA。

1.4.2 PCR 扩增 25μl 反应体系（2X multiplex PCR Mix 12.5μl,DNA 模板 2.5μl,引物(10pmol/μl)：0.1μl/条（1 号和 16 号为 0.2μl/条）,ddH2O 7.9μl）,反应步骤：预变性（95℃，15min）,35 个循环（95℃、30s,57℃、60s，72℃、60s），延伸（72℃、10min）。

1.4.3 产物电泳 取5μl 扩增产物加入1.5%琼脂糖凝胶孔中，电压140V，时长35min，结束后取出凝胶放置于紫外分析仪下读取结果且拍照。

2 结果

2.1 GBS 菌株分离情况 2019 年 6 月-11 月共筛查了10145 例住院孕妇生殖道分泌物，共检出149株GBS,检出率为1.47%。

2.2 GBS 分型结果 部分电泳结果，见图1,血清型分型依照表1。选取94 例孕妇携带的GBS 成功分出 7 个血清型,分别为 Ib 型 33 株(35.1%)，III 型 25株(26.6%)，Ia 型 22 株(23.4%)，V 型 5 株(5.3%)，II型和 VI 型各 4 株(4.3%)，IX 型 1 株(1.0%)，未检出IV 型、VII 型、VIII 型。

2.3 不良妊娠结局与血清型关系 见表2。选取的94 例孕妇，出现早产、胎膜早破、宫内感染、胎儿宫内窘迫和死胎等并发症。

3 讨论

B 族链球菌为人畜共患菌, 早在1887 年报道主要感染奶牛, 引起奶牛乳腺炎而致牛产奶量降低，因此又称为无乳链球菌。Fry 于1938 年首次报道了3 例死于B 族链球菌产后心内膜炎病例,从而认识到 GBS 可感染人类[8]。直到 20 世纪 70 年代,研究发现GBS 成为美国新生儿死亡的首要原因，才引起社会的广泛关注。我国近几年报道的GBS导致母婴疾病病例增多,大量的研究也因此逐步开展。

GBS 呈全球分布,不同地区孕妇定植情况存在差异，最新的一篇文献[9]对85 个国家299924 例孕妇GBS 携带情况进行了分析, 共分离获得16882株GBS 并分析了血清型，发现全球孕妇GBS 平均定植率为18%，变化差异为11%~35%，亚洲地区最低，非洲地区最高。我国的孕晚期妇女GBS 定值率3.5%~32.4%[10]。III 型是最主要的血清型，血清型 Ia、Ib、II、III 和 V 型 在 所 有 地 区 孕 妇 定 植 的GBS 中占98%,而VI-IX 血清型主要分离自亚洲地区，其他地区少见。

图1 部分菌株血清型PCR电泳图

表1 GBS血清分型参照表（血清型别与相应扩增产物大小）

表2 血清型与妊娠并发症

GBS 临床检测方法主要有传统培养法、免疫层析法、普通PCR、实时荧光定量PCR、显色平板法以及环介导等温扩增（LAMP）法等，各种方法的灵敏度和特异性有差异，但传统培养法特异性高，实时荧光定量PCR 灵敏度和特异性都较好, 所以是目前临床使用最多的两种检测方法。

为预防GBS 感染，西方大多数国家采用美国2010 年 CDC 推荐方案[11]，即对 35~37 周孕妇常规筛选，阳性孕妇在分娩前24h 进行抗生素预防性治疗，以降低母婴感染机会。但是药物的耐药性和对新生儿的不良影响是值得关注的。所以最好的预防措施是研发GBS 预防疫苗，常选用CPS 作为抗原并耦联蛋白增加免疫原性。因CPS 具有10 个血清型，且不同地区的型别有所差异，所以查明当地的血清型可以为多价疫苗研发提供理论支持。常规血清分型方法是兔抗血清分型，但该试剂昂贵，存在交叉反应和未定型血清型等缺点，现在多重PCR 技术能很好的替代该方法，在常规分子实验室可以开展，方便大样本量GBS 血清型流行性调查。

本研究分离的菌株来源于10145 例住院孕妇生殖道标本，培养为常规细菌培养方法，可能低估了当地孕妇GBS 携带率(1.47%)。选取的94 株GBS成功分出7 种血清型，主要以Ib 型33 株(35.1%)和 III 型 25 株 (26.6%) 为主, 其次是 Ia 型 22 株(23.4%);广东[12]地区以 III 型（74%）、Ib 型（18%）为主；北京[13]地区主要血清型有Ⅲ型(41.7%)，Ia 型(13.5%)，V 型(18.8%)。在西澳大利亚[14]孕妇携带的GBS 血清型主要是 Ia(27.9%)，III(20.9%)，II(16.3%);韩国[15]孕妇携带的血清型以III 型（26.3%）主要，其次是血清型 Ib（21.1%），V（15.8%）。表明江西中部地区与其他地区型别有一定差异，值得一提的是，表2 结果显示7 种血清型中, 妊娠感染GBS 并发早产以III 型和Ia 型为主, 胎膜早破以Ia 型和Ib型为主，最常见的感染并发症是胎膜早破，甚至还有死胎情况。

本研究发现, 不同地区孕妇携带GBS 情况差异较大。本地区血清型以Ib 型和III 型为主，妊娠并发症与血清型别存在一定关联性。规范检测方法，加大筛查力度，仍然是目前预防GBS 感染孕妇和新生儿最好的措施。