高通量测序技术在循环肿瘤DNA检测中的应用
2021-12-04李斯特徐文博
李斯特,徐文博
(思路迪医学检验所有限公司)
肿瘤已成为人生命健康的重要威胁因素,我国每年新发癌症病例约392.9 万例,癌症死亡约233.8 万例,发病率接近世界平均水平,死亡率更是高于世界平均水平[1]。肿瘤发生是一个渐进的过程,基因突变通常发生在肿瘤发生过程中,可用于肿瘤诊疗。现有肿瘤基因诊断方法主要基于组织活检以及液体活检,组织活检通常存在组织异质性、肿瘤内异质性、转移间异质性和时间异质性,存在一定的局限性,可能导致错失针对性治疗机会或治疗干预不当。对比传统组织活检,液体活检具有非侵入性、患者依从性高、取样量少、取样风险低、特异性高、可重复多次取样等优点,并且可解决肿瘤异质性的问题,在肿瘤的早期辅助诊断、伴随诊断、治疗监测、预后评估等方面的应用价值极高,液体活检可能是未来几年肿瘤最具影响力的领域之一[2,3]。
液体活检检测的样本主要包括循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)和外泌体等,其中 ctDNA是目前临床实验室应用最多的液体活检靶标。尽管近年来ctDNA 的研究取得了大量的成果,但ctDNA 作为生物标志物在临床应用中仍存在许多技术问题。这主要是因为与正常体细胞DNA 相比,ctDNA 具有以下独特的特征:(1)它处于动态、实时变化的状态,ctDNA 含量随肿瘤分期的变化而动态变化;(2)半衰期短,通常为2h[4];(3)DNA 片段破碎程度高,在酶切的作用下,长度主要在166 bp 左右[5];(4)与大量野生型DNA 共存,血液中突变型ctDNA 的拷贝数仅为野生型的1%或更少,野生型DNA 中仅一个碱基差异即可严重干扰突变型ctDNA 的检测[6];(5)浓度低,每毫升血浆样本中只有几十个ctDNA 拷贝。这些特征使得ctDNA 的检测比体细胞更难。因此,检测ctDNA 的技术平台需要具有高度的特异性和灵敏度。
1 NGS技术是检测ctDNA的核心技术
ctDNA 是一类来源于肿瘤细胞的循环游离DNA (cfDNA),由肿瘤细胞凋亡、坏死或分泌产生的DNA 片段[7,8]。一般来说,ctDNA 包含与产生 ctDNA的肿瘤DNA 相同的基因缺陷,如突变、缺失、插入、重排、 拷贝数异常以及甲基化等相关突变信息。ctDNA 在肿瘤细胞凋亡或坏死后进入循环系统时,保留了相对完整的遗传信息。肿瘤细胞中的大部分DNA 突变都可以在ctDNA 中得到反映,通过检测ctDNA,可以获得大量的肿瘤信息。检测结果可用于判断肿瘤突变类型、肿瘤分期、复发转移的可能性。
目前,实验室常用的ctDNA 检测方法目前主要分为靶向检测和非靶向检测,靶向检测的目的是识别一个或几个常见靶向治疗相关基因的已知突变,检测技术为基于聚合酶链式反应(PCR)技术,包括荧光定量PCR、数字PCR(digital PCR,dPCR)和核酸质谱检测等; 非靶向检测的目的则是同时识别多基因,包括肿瘤治疗相关的已知突变及未知突变,检测技术以高通量测序(next generation se-quencing,NGS)为主,随着 NGS 技术的高速发展,其通量高、敏感度高及对DNA 样本浓度要求低等优点,已成为液体活检实验室检测的核心技术。
2 NGS技术检测ctDNA技术的选择
NGS 技术能一次并行对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定,具有高通量和高自动化程度,可以在短时间内完成数千亿碱基的测序,对比一代测序(Sanger 测序),NGS 对 DNA 模板的浓度和纯度要求更低,通过对同一区域的DNA 片段进行重复测序,可实现高深度测序,因而获得了更高的灵敏度、特异性和准确性,也正是由于NGS 技术的技术优势,使得NGS 技术非常适合样本浓度低、高度片段化的ctDNA 检测。尽管NGS 具有较高的灵敏度和特异性,但根据应用平台的不同,其随机错误率在0.1%至1%之间[9],这使得通过总cf DNA 中的罕见突变检测ctDNA 具有挑战性。因此NGS 在ctDNA 的检测中衍生了多个应用技术,包括全基因组测序(whole-genome sequencing, WGS)、全外显子组测序(whole-exome sequencing, WES)、深 度 测 序 、TAm-Seq (tagged-amplicon deep sequencing,标记扩增深度测序)、 Safe-SeqS(safe-sequencing system,安全测序系统)和CAPP-Seq(Cancer Personalized Profiling by Deep Sequencing,深度测序肿瘤个体化建档法)等。
2.1 全基因组测序 (WGS) 全基因组测序是对生物全基因组序列进行测序,以获得完整的基因组信息,可检测的突变类型包括点突变、Indel、重排和CNV。ctDNA 在转移性癌症中具有很高的敏感性和特异性[10]。但是,ctDNA 测定都依赖于复发基因中的特定突变或需要对肿瘤组织进行测序,这无疑给转移性癌症的预后检测带来了阻碍。Aguilar-Mahecha A 等[11]通过低深度全基因组测序技术(lowpass whole genome sequencing, low-pass WGS)对转移性乳腺癌患者的ctDNA 进行检测,将患者DNA的拷贝数变化用于计算基因组不稳定性数(GIN),该研究结果表明,基线、早期、治疗时的GIN 值和动态变化可以预测治疗的反应,以及总生存期。通过该方法既可以预测3 个月的早期肿瘤反应,也可以预测预后,为转移性乳腺癌早期预测及预后提供了更可行的方法。
2.2 全外显子组测序 (WES) 全外显子组测序是一种广泛使用的NGS 方法, 人类外显子组所占基因组的比例不超过2%,但它包含了约85%已知与疾病相关的变异[12],WES 和WGS 之间最大的区别是生成的数据的数量和内容。一般来说,如果目标是寻找目标突变,WES 更适合,并且成本会更低,这使得该方法成为全基因组测序的一种经济高效的替代方法。在非小细胞肺癌的治疗中,尽管免疫检查点抑制剂(ICIs)延长了部分晚期非小细胞肺癌(N SCLC)患者的肿瘤反应,但大多数患者会出现继发性耐药,了解ICIs 的晚期进展机制对改进未来的预后治疗策略很重要。Etienne Giroux Leprieur 等[13]对8 例非小细胞肺癌患者ctDNA 进行了全外显子组测序(whole- exome sequencing, WES),并比较了使用ICIs 治疗的晚期NSCLC 患者在至少治疗6个月后,初始和延长肿瘤应答并出现继发进展的患者在ICI 治疗开始和肿瘤进展之间的分子谱,首次发现了Wnt 通路在晚期NSCLC 继发性耐药中的作用, 对非小细胞肺癌的晚期治疗提供了新的思路。
全基因组测序(WGS)或全外显子组测序(WES)的优势包括:(1)能够识别肿瘤治疗过程中发生的新变化,发现新的未知突变;(2)不需要关于原发肿瘤基因组的信息。在科研级的ctDNA 研究中有广泛的使用,并且已经走进了“千元基因组”时代。然而对于临床级的使用,无论是WGS 还是WES 都需要较高的样品量,并且需要花费大量的设备、场地、人员资质、数据解读等相关成本,这阻碍了它们在临床用于筛查和早期诊断的推广。
2.3 DNA 甲基化测序 ctDNA 的甲基化水平可用于肿瘤的诊断。目前美国食品药品监督管理局(FDA)已批准血浆SEPT9 基因甲基化检测,可作为结直肠癌的筛选试验。CFDA 目前批准了SHOX2、 RASSF1A 基因甲基化检测,通过肺泡灌洗术获取可溶性渗出物, 用于早期肺癌的辅助诊断。但是已批准的ctDNA 突变或甲基化检测,均基于荧光定量PCR 的方法,该方法的检测灵敏度有限。近年来结合数字PCR、NGS 等方法,液体活检的检测灵敏度有大幅提升。其中测序方法的应用大大提高了检测通量并能发现更多潜在的肿瘤变异。最近,基于cfDNA 全基因组测序发现,起源于肿瘤的ctDNA 存在片段图谱的特征性改变,这为未知肿瘤的筛查监测提供了一种新的分析方法。肿瘤发生早期,DNA 已经出现了甲基化的趋势或CpG 局部甲基化的改变,因此可以通过体液活检检测ctDNA 的水平和甲基化特征来实现肿瘤的早期诊断以及分期[14]。另外,DNA 甲基化异常则可提示肿瘤的侵袭性和手术切除后复发的风险。由于ctDNA 的半衰期较短(约 2h)术后 ctDNA 在血液中的持久性与较差的预后相关[15]。ctDNA 的甲基化测序后特征可以预测癌症患者的术后复发及死亡风险,有助于调整治疗方案,评估是否需要术后化疗以及确定化疗方案。
2.4 靶向测序 (targeted sequencing, TS) 为了利用NGS 更快速地检测目的基因突变,并在保证检测准确性和测序深度的基础上降低成本,靶向测序(targeted sequencing, TS) 正受到越来越多的关注。与WGS 和WES 相比,TS 可以获得更大的覆盖范围和更高的数据精度,提高目标区域的检测效率。同时缩短了检测周期,降低了测序成本,适合分析大量样本。目前,通过TAm-Seq、CAPP-Seq 等方法进行癌症个性化分析, 是ctDNA 靶向深度测序的主要技术。TAm-Seq 的检出限为0.02%,对循环DNA中EGFR 点突变的特异性为99.9997%[16],保证了高特异性及高灵敏度;CAPP-Seq 在NSCLC 患者中检测EGFR 突变也是高度敏感, 特异度>99.99%[17,18],两种方法是研究ctDNA 非常实用的测试方法,但是TAm-Seq 以及CAPP-Seq 均只能检测已知突变,对于研究未知突变有一定的局限性。若通过对高覆盖的靶区(>10,000×)进行测序,其灵敏度可达到0.02%,特异性可达到80%[19],有研究通过独特分子标记(UMT)和下一代超深度测序检测在早期或晚期乳腺癌患者中的ctDNA[20],由于ctDNA 的含量非常低,因此以排除克隆造血(CH)来源的变异,该研究对于突变的患者,采用相应的白细胞(WBC)的DNA 进行对照测序,排除CH 突变后,局部或局部晚期乳腺癌(I-III 期)的ctDNA 检出率为37%,转移性或复发性乳腺癌的ctDNA 检出率为81%,为乳腺癌的靶向治疗提供了新的检测方法,通过血浆ctDNA 和WBC 进行配对测序可以提高液体活检的准确性。
3 NGS技术检测ctDNA临床应用
ctDNA 相关标志物在临床应用的研究领域包括伴随诊断指导用药、治疗监测、早期辅助诊断等多个方面。目前国内批准的ctDNA 基因突变检测试剂的方法为ARMS-PCR 的方法,而基于NGS 技术检测ctDNA 的试剂仅在美国FDA 有获批,但是基于NGS 技术ctDNA 基因突变检测的肿瘤早期辅助诊断,术后肿瘤复发监测、肿瘤治疗后效果评估、微小残留病灶诊断(MRD)等前沿性临床应用的开发及研究成果层出不穷,为未来的临床推广带来希望。
3.1 肿瘤早期筛查 肿瘤早期筛查 (简称癌症早筛)是指借助于快速、简便、有效的方法,从大量无症状的“健康”人群中筛选出肿瘤高危群体或者肿瘤阳性患者的过程。由于肿瘤的早期发现可以进行提前干预,明显降低死亡率、延长生存期,因此肿瘤早筛具有非常重要的意义。近年来ctDNA 研究重心逐步前移到肿瘤超早期筛查上,有研究标明[21],接受手术和辅助治疗的乳腺癌患者,对16 个与原发肿瘤相关的突变,在这些动态采集的血浆ctDNA样本中进行超深NGS 测序。发现18 例复发患者中,高达16 例ctDNA 检测结果早于常规影像学发现,31 例未复发患者任一时间点血浆样均为ctDNA 阴性,特异性为100%。美国GRAIL 公司计划2021 年推出的液体活检产品Galleri 是一项基于cfDNA 靶向甲基化的血液检测分析方法,该检测可区分多阶段的50 多种癌症类型,包括缺乏筛查指南的高死亡率癌症和早期癌症, 可作为一种LDT检测用于50 岁以上的无症状人群的癌症筛查。
3.2 肿瘤微小病灶残留检测 微小残留病灶(Minimal Residual Disease,MRD),是癌症治疗后残留在体内的少量对治疗无反应或耐药的癌细胞,传统影像学或实验室方法不能发现,但可通过液体活检发现癌来源分子存在异常,代表肿瘤的持续存在和临床进展可能。根据我国《肺癌MRD 的检测和临床应用共识》,肺癌分子异常指的是外周血可稳定检出丰度≥0.02%的ctDNA,包括肺癌驱动基因或其他的I/II 类基因变异。MRD 检测技术包括RTPCR、流式细胞术、数字微滴PCR 和NGS,目前处于探索阶段,需要前瞻性研究确定其敏感性、特异性和预测价值。对于早期或晚期肿瘤患者进行MRD 检测,可有助于判断手术或治疗后预后,和制定进一步的治疗策略。目前一些研究进展表明MRD 可用于白血病、肺癌、结直肠癌和乳腺癌的预后和治疗方案评估[22-28]。
目前国外一些商业化MRD 检测开始应用到临床。Natera 公司的Signatera 检测产品获得美国FDA“突破性设备”认定,能够个体化设计16 种独特的克隆性体细胞变体,随后进行多重PCR(mPCR)和超深度测序(靶标平均>100,000 个reads),用于全血样品纵向ctDNA 分析并检测微小残留病变(MRD)。2021 年美国纽约州卫生部临床实验室评估项目 (CLEP) 批准了 Guardant Health 公司的Guardant Reveal 液体活检产品用于检测和监测早期癌症患者(结直肠癌,CRC II 和III 期)的MRD,意味着纽约州的肿瘤科医生可以使用Guardant Reveal 的MRD 检测来识别可能受益于辅助治疗的结直肠癌高风险患者和监测癌症复发。
3.3 肿瘤伴随诊断指导用药 美国FDA 于2020 年8 月 7 日已批准 Guardant Health 基于 NGS 的液体活检测定法,Guardant360 CDx,用于患有任何实体恶性肿瘤的晚期癌症患者的肿瘤突变图谱分析,同时还被批准为一种辅助诊断方法,用于识别表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的转移性非小细胞肺癌(NSCLC)患者,这些患者可能会受益于奥西替尼的治疗。这是FDA 批准的首个将NGS 和液体活检技术结合,指导临床治疗决策的诊断检测。2020 年美国FDA 批准了基于NGS 的液体活检伴随诊断大 panel 检测产品 FoundationOne Liquid CDx 上市,该产品可检测324 个基因的变异信息及免疫治疗相关的生物标志物血液微卫星不稳定性(bMSI)和血液肿瘤突变负荷(bTMB),适用于泛实体瘤,并作为多个靶向药物的伴随诊断。
4 展望
随着检测技术的更新迭代,液体活检技术也在飞速发展中, 虽然ctDNA 是目前液体活检技术中使用最多的标志物,但是我们也看到在实际检测中依然存在着一些挑战, 技术上对检测灵敏度要求高、对测序深度要求高,临床应用上还缺乏大量的临床有效性证据。高通量测序具有的高灵敏度和高通量,已成为ctDNA 检测的主流技术平台,虽然在前沿性的科研中,NGS 技术能够大放异彩,但在临床应用中却还在初级阶段,一方面是由于临床级测序价格高,需要开展单位拥有从平台建设到人员资质全力投入, 另一方面由于NGS 技术发展速度快,开发符合政府监管的产品周期非常长,往往拿到注册证时,检测的产品也有些过时了。因此NGS技术在ctDNA 检测的发展应用中,是机会与挑战并存的,需要不断完善技术,加快临床转化,才能造福患者。