甲状腺癌组织中IL17RD、LIN52、ESM-1 表达及其与临床病理特征和预后的关系

刘松鸽，王军凯，李晓娜，张发顺

（河南科技大学附属许昌市中心医院病理科，河南 许昌 461000）

甲状腺癌是常见的内分泌系统恶性肿瘤，其发病率呈逐年增长趋势[1]，并且发病年龄逐渐年轻化[2]。目前，甲状腺癌的治疗以外科手术为主，辅助放疗和化疗。影响甲状腺癌发生发展的因素较为复杂，临床迄今尚无公认的肿瘤免疫学指标或者基因学标记对判断其预后[3]。因此，甲状腺癌标志物的发现对于该疾病的早期诊治及预后判断具有积极意义。白细胞介素17 受体D （interleukin-17 receptor D，IL17RD），又被称为人成纤维细胞生长因子类似表达基因,其可能通过调控成纤维细胞生长因子和MAP 激酶信号转导途径参与多种疾病的发生发展[4-6]。内皮细胞特异性分子-1（endothelial cell specific molecule-1，ESM-1）是一种可溶性的蛋白多糖，参与调节血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 及多种恶性肿瘤的侵袭和转移，与肿瘤的发生发展及预后密切相关[7,8]。LIN52 是转录因子配对基因基因家族成员之一，在胚胎发育、细胞的增殖与分化、肿瘤生长的血管系统的形成等生理或病理过程中发挥重要调控作用[9]。本研究旨在探讨IL17RD、ESM-1 和LIN52 在甲状腺癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系，以期为甲状腺癌的早期诊断和预后判断提供理论实验依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选取 2014 年 1 月-2016 年 11 月于本院行手术治疗的125 例甲状腺癌患者为研究对象，其中男性 73 例，女性 52 例，年龄 35～79 岁，平均年龄63.84±6.49 岁。根据病理类型的不同分为甲状腺乳头状癌 （47 例）、 滤泡状甲状腺癌（36例）、髓样甲状腺癌（28 例）和未分化癌（14 例）；根据TNM 分期分期不同，Ⅰ期19 例，Ⅱ期26 例，Ⅲ期49 例，Ⅳ期31 例；根据分化程度不同，高分化31 例，中分化 39 例，低分化 55 例。发生淋巴结转移有51 例，无淋巴结转移74 例。排除标准：⑴合并其他肿瘤患者；⑵合并心脏、肝、肾等重要器官障碍者；⑶合并自身免疫系统疾病患者。所有患者术前未进行放、化疗等治疗。

本研究经本院伦理医学委员会批准同意，患者或其家属知情同意并自愿签署知情同意书。

1.2 实时荧光定量 PCR 检测组织中 IL17RD、LIN52 和 ESM-1 的 mRNA 表达水平 应用 RNA提取试剂盒（德国Qingen 公司）提取甲状腺癌组织和对应癌旁组织中总RNA，微量核酸仪检测RNA的纯度和浓度。应用Quanti Tect 反转录试剂盒将提取的RNA 反转录为cDNA。然后以cDNA 为模板进行 PCR 扩增。扩增条件95℃预变性 5min，95℃变性 10s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s,共 35 个循环。IL17RD 上游 5' -FACATAAACAGTCTCAAAC TCGCAC-3'，下游 5'-CTGATCCTAAAGCCCTTACAACTAA-3'；LIN52 上游 5'-GTTTACCTGA AGAGCTCTGGTAC-3',下游 5'-CCTTATCTGCTAGTGTCGACATCAT -3'；ESM 上 游 5' -ACTAT GCTGAAGTCTTAGGA-3', 下游 5'-TCAGAACTG AGTAAGGCCTG-3'；GAPDH 上 游 5'-GAT TGTT GCCATCAACGACC-3',下游 5'-GTGCAGGATGCA TTGCTGAC-3'。以 GAPDH 为内参，采用 2－△△Ct法计算组织中 IL17RD、LIN52 和 ESM-1 的 mRNA 相对表达水平。

1.3 免疫组织化学法检测组织中IL17RD、LIN52和ESM-1 蛋白表达 组织采用石蜡包埋、 切片机切取组织，厚度5mm。将切片置于60℃恒温箱中烘烤60min 后，30%双氧水进行脱蜡处理。蒸馏水清洗后，微波抗原修复。切片自然冷却后，PBS 洗涤3次，每次 3min。5% BSA 室温封闭 20min。滴加一抗，4℃孵育过夜。PBS 洗涤 3 次，每次 3min。滴加二抗，37℃孵育 30min。滴加 DAB 显色试剂，流水冲洗干净，苏木精复染2min，颈托税后树胶封固，镜检。显微镜下随机选取5 个视野，对阳性染色细胞数以及染色强度进行评价。评价标准：⑴染色强度：无色记为0 分，淡黄色记为1 分，棕黄色记为2分，褐色或黑色记为3 分；⑵阳性细胞比例：＜10%记为 1 分，10%～50%记为 2 分，51%～75%记为 3分，＞75%记为 4 分。两种分数的乘积≤3 分为阴性，＞3 分为阳性。

1.4 统计学分析 利用SPSS.22.0 软件分析实验数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示;计数资料以例数或百分比表示。两组间比较采用t 检验;多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用SNK-q 检验。以 P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲状腺癌组织中IL17RD、LIN52 和 ESM-1 的mRNA 表达水平 与癌旁组织比较，甲状腺癌组织中 IL17RD、LIN52 和 ESM-1 的 mRNA 表达水平均显著升高（P＜0.05）。见表1。

表1 甲状腺癌组织中IL17RD、LIN52和ESM-1 的mRNA表达水平

2.2 甲状腺癌组织中IL17RD、LIN52 和 ESM-1 蛋白阳性表达率 甲状腺癌组织中IL17RD、LIN52 和ESM-1 蛋白阳性表达均主要定位于细胞质。与癌旁组织比较，甲状腺癌组织中IL17RD、LIN52 和ESM-1 蛋白阳性表达率均显著升高（P＜0.05）。见图1，表2。

图1 免疫组化染色结果

表2 甲状腺癌组织中IL17RD、LIN52 和ESM-1 蛋白阳性表达率

2.3 IL17RD、LIN52 和 ESM-1 表达与甲状腺癌临床病理特征的关系 IL17RD、LIN52 和 ESM-1 表达与甲状腺癌患者年龄、性别、肿瘤直径以及病理类型无明显相关性（P＞0.05），与 TNM 分期、分化程度和淋巴结转移具有明显的相关性（P＜0.05），并且TNM 分期越高、分化程度越低、发生淋巴结转移时IL17RD、LIN52 和ESM-1 蛋白表达阳性率越高。结果如表3 所示。

2.4 IL17RD、LIN52 和 ESM-1 蛋白表达与甲状腺癌预后的关系 Kaplan-Meier 生存曲线分析显示，IL17RD、LIN52 和 ESM-1 蛋白阳性表达患者 3 年生存率均显著低于阴性表达患者(P＜0.05)。见图2。

表3 IL17RD、LIN52 和ESM-1 表达与甲状腺癌临床病理特征的关系

图2 IL17RD、LIN52 和ESM-1 蛋白表达生存曲线

2.5 甲状腺癌患者预后影响因素的多因素Cox 回归分析 Cox 回归分析显 示，IL17RD、LIN52 和ESM-1 蛋白阳性表达均是影响甲状腺癌预后不良的独立危险因素（P＜0.05）。见表4。

3 讨论

甲状腺癌是内分泌系统常见的恶性肿瘤，具有较高的发病率。甲状腺癌的发生受遗传、环境等多种因素的影响,其发生可通过增加远处器官转移导致患者病死率增加[10]。目前，临床缺乏有效的早期诊断甲状腺癌的方式，寻找用于早期诊断甲状腺癌的生物学标志物对于甲状腺癌的早期治疗以及改善预后具有重要意义。

表4 Cox回归分析甲状腺癌预后影响因素

IL17RD 与其配体IL-17 不仅在炎症反应中起重要作用，还参与肿瘤疾病的发生和发展[11,12]。本研究结果显示，甲状腺癌组织中IL17RD 的mRNA 和蛋白阳性表达率均明显高于癌旁组织，其阳性表达与肿瘤TNM 分期、分化程度、淋巴结转移和局部浸润等临床病理特征具有明显相关性，与刘美宏等[13]报道的结果一致。本研究还显示，IL17RD 阳性表达的患者3 年生存率低于阴性表达患者，实影响甲状腺癌预后的独立危险因素，说明IL17RD参与甲状腺癌的发生发展，原因可能与IL17RD 表达升高促进成纤维生长因子的表达，促进肿瘤血管生成有关[14]，提示IL17RD 可作为甲状腺癌诊治和预后判断的生物学标记物。

ESM-1 主要表达于血管内皮细胞,是肿瘤内皮组织血管侵袭的生物标志物。罗雪慧等[15]研究显示, 子宫内膜腺癌组织中ESM-1 蛋白阳性表达明显高于正常子宫内膜组织,与子宫内膜病变程度密切相关，参与子宫内膜癌的发生、发展。本研究结果显示，ESM-1 在甲状腺癌组织中的mRNA 水平以及蛋白阳性表达率均明显高于癌旁组织,其蛋白阳性表达率随肿瘤分期逐级递增，随分化程度高、中、低逐渐递增，随有、无淋巴结转移依次递减，与相关报道结果一致[16]，提示ESM-1 可能与甲状腺癌的发展、转移和侵袭等息息相关。

作为转录因子配对基因基因家族成员，LIN52基因可调控白细胞介素 8（IL-8）和 VEGF，LIN52蛋白高表达的淋巴细胞能够分泌更多的IL-8 和VEGF，参与炎症反应及肿瘤血管生成[17]。Luo 等[18]研究显示，胃癌组织中LIN52 的mRNA 表达水平升高，LIN52 高表达的患者对化疗敏感性低于低表达患者，可能是胃癌诊治和预后判断的生物学指标。本研究结果显示，甲状腺癌组织中LIN52 的mRNA 和蛋白阳性表达率均明显高于对应的癌旁组织，并且甲状腺癌TNM 分期越高、肿瘤分化程度越低、 发生淋巴结转移以及出现局部浸润时，LIN52 蛋白阳性表达率越高，说明LIN52 参与甲状腺癌的发生发展过程，其与甲状腺癌的转移侵袭等密切相关，原因可能是高表达LIN52 的肿瘤细胞对内皮细胞的黏附能力更强，而肿瘤细胞需要与内皮细胞紧密结合才能通过细胞外基质层[19,20]。

综上所述，甲状腺癌组织中IL17RD、LIN52、ESM-1 的mRNA 和蛋白均呈高表达，可作为甲状腺癌预后判断的生物学指标。