外周血与尿沉渣microRNA-145 表达与冠心病患者疾病程度的相关性研究

魏艳胜，张永春，黄陆力，王学惠，张俊彪，刘辉

（新乡医学院第一附属医院心内科，河南 新乡 453100）

冠状动脉粥样硬化性心脏病，冠心病(coronary atherosclerotic heart disease，CAD)是指因动脉粥样硬化或动力性血管痉挛引发的冠状动脉器质性狭窄、阻塞或供血不足，最终导致心肌缺血缺氧(心绞痛)或心肌坏死(心肌梗塞)等心肌机能障碍的心脏病，严重威胁人群的身体健康，是全球死亡率最高的疾病之一[1,2]。冠心病的诊断主要依赖典型的临床症状结合辅助检查，证实心肌缺血或冠脉阻塞的，以及是否有心肌坏死[3]。临床上治疗冠心病的目的是缓解症状，减少心绞痛的发作及冠心病；延缓冠状动脉粥样硬化病变的发展，并减少冠心病死亡，早期诊断和合理预防对冠心病的治疗及预后具有十分重要的意义。目前临床上广泛采用总胆固醇（TC）、 低密度脂蛋白 （LDL-C）、 高密度脂蛋白（HDL-C）、甘油三酯（TG）、B 型利钠肽前体（Pro-BNP），肌钙蛋白 I （cTnI）、肌酸激酶同工酶（CKMB）等生化标记物来评估CAD 患者的疾病发展情况，然而这些指标在非CAD 的败血症、肺栓塞等危重疾病患者中亦出现升高[4]。而microRNAs 作为基因表达的调节剂,近年来已经发展为一个生物肿瘤治疗领域的新靶点,广泛参与并有效涉及多种生物及细胞的增殖、分化、凋亡代谢自我更新等过程[5]，国内外研究表明，microRNA-145 在心肌缺血缺氧和复氧损伤的调控机制中发挥重要的作用[6]。本研究通过收集2016 年1 月-2017 年 12 月本院收治的100 例冠心病患者的血清和晨尿,旨在探讨血清和尿沉渣 miR-145 用于冠心病诊断、 治疗及预后的临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床一般资料 2016 年 1 月-2017 年 12 月本院收治的100 例冠心病患者作为观察组，诊断标准及入选标准，并依据NYHA 分级法进行分级，IIV 级，诊断标准符合2014 年美国和欧洲稳定性冠心病诊治指南的诊断及分类诊断标准[7]：冠心病确诊为冠脉造影时左主干、前降支、回旋支、右冠脉或其主要分支的血管直径狭窄(至少1 支冠状动脉直径狭窄＞50%)。入选标准：⑴经头CT 排除脑出血及其他脑性疾病;⑵近1 个月内未服用过任何类型的抗凝药物和影响纤溶活性的药物,未服用过任何类型的抗生素、激素、非甾体抗炎药等；⑶患者不具有肝、肾功能不全，贫血、肿瘤，凝血功能异常及自身免疫性疾病、甲状腺功能障碍等；(4)无手术外伤史。本研究经本院伦理委员会批准，患者自愿签署知情同意书。以同期98 例于我院行健康体检者为对照组。见表1。

表1 两组对象一般资料比较

1.2 样品收集 所有患者均在我科进行基础药物及溶栓治疗：抗血小板、利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）、β 受体阻滞剂等，患者给予卧床休息、吸氧、低盐低脂饮食、心电及血氧饱和度监测等。清晨空腹采集各组患者静脉血 5ml，2000rpm/min 离心15min，取上层血清待检。收集各组患者晨起中段尿10ml,2000rpm/min 离心15min，取尿沉渣用于提取RNA。

1.3 观察指标 采用全自动生化分析仪检测患者血清中的总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、甘油三酯（TG）、B 型利钠肽前体（Pro-BNP）,肌钙蛋白 I （cTnI）、肌酸激酶同工酶 （CK-MB）。Trizol 法提取血液和尿液内总RNA，用含有gDNA 橡皮擦功能的PrimeScriptRT试剂盒进行逆转录, 合成cDNA 进行并扩增，以U6snRNA 为内参照基因，用SYBR Premix Ex TaqII试剂盒按照说明书操作，进行实时荧光定量Realtime PCR 分析。每个实验至少重复3 次。分析:通过计算miR-145 基因的表达含量。取1μg 总RNA 利用M-MLV 逆转录酶说明书反转录合成cDNA，内参选用U6。逆转录引物序列miR-145：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCG AGGTATTCGCACTG -GATACGACCGCGAGG-3'，采用 AB I7000 实时定量PCR 仪进行逆转录。RT-PCR 反应引物序列miR-145： 上游引物序 5'-GGCTTC GTA CCG TGAGTAAT-3'，下游引物序列5'-GTGC AGGGTC CGAGGT-3'；U6：上游引物系列 5'-GCTTCGGCAG CACATATACTACATATACTAAAAT-3',下游引物序列 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反应体系：95℃孵育 30s，循环程序共 40 个循环，变性95℃，15s；退火 60℃，20s；延伸 70℃，60s。每个样本均进行三次检测，应用2-△△CT法计算miRNA-145的相对表达水平并对其进行 log2-△△CT转换，ΔΔCT=实验组(CTmiRNA-145-CTU6)-对照组(CT-miRNA-145-CTU6)，采用-ΔΔCT 表达 MicroRNA-145 的相对水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件进行数据处理，计量资料符合正态分布和方差齐性检验，计量资料结果用±s 表示，采用单因素方差分析和T 检验进行计量资料组间差异比较。计数资料采用例数（%）表示，组间差异采用卡方检验，诊断实验评价采用ROC 曲线的绘制；miR-145 与冠心病分期及术后复发的关系使用两两直线相关性分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 入院指标检测比较 相比于对照组, 观察组miRNA-145 含量升高（P＜0.05）。见表2。

表2 两组对象入院指标检测比较

2.2 观察组血清内miR-145 mRNA 含量表达 随着NYHA 分级加重，患者血清中的miR-145 mRNA 含量表达显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。患者采用常规方法治疗后，患者血清中的miR-145 mRNA 含量表达显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 观察组血清内miR-145 mRNA含量表达

2.3 观察组尿沉渣中miR-145 mRNA 含量表达随着NYHA 分级加重，患者尿沉渣中的miR-145 mRNA 含量表达显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。患者采用常规方法治疗后，患者尿沉渣中的miR-145 mRNA 含量表达显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表4。

2.4 血清及尿沉渣中miR-145 诊断价值 观察组血清miR-145 诊断曲线下面积AUC 为0.79，灵敏度为75.00%，特异性为80.00%。观察组尿沉渣中miR-145 诊断曲线下面积AUC 为0.62，灵敏度为65.00%，特异性为72.00%，见表5。

表4 观察组尿沉渣中miR-145 mRNA含量表达

表5 血清及尿沉渣中miR-145 诊断价值

2.5 血清及尿沉渣中miR-145 与观察组疾病程度的相关性 随着冠心病患者NYHA 分级的加重，观察组血清及尿沉渣中miR-145 mRNA 含量与患者疾病程度呈明显负相关（P＜0.05），见表6。

表6 血清及尿沉渣中miR-145 与观察组疾病程度的相关性

2.6 血清及尿沉渣中miR-145 与观察组冠状动脉粥样硬化的相关性 随着冠心病患者NYHA 分级的加重，观察组血清及尿沉渣中miR-145 mRNA含量与患者 TC、LDL-C、CK-MB、CTnl 及 Pro-BNF含量呈明显负相关，与患者HDL-C 和TG 含量呈明显正相关（P＜0.05），见表7。

表7 血清及尿沉渣中miR-145 与观察组冠状动脉粥样硬化的相关性

3 讨论

近年来，大量研究表明miRNA 表达的上调或下调足以引起一些特异性的心血管疾病的发生和发展，包括促进血管内皮细胞的发育、分化、增殖和凋亡等多种生物学过程[8]。miR-145 是血管内皮上的特殊的miRNA,其靶基因 Ephrin-A3 是 VEGF介导血管新生信号通路的重要信号分子,参与调控Hif-1a-VEGF 信号通路，miR-145 在心梗后的血管发生和维持血管的完整性上起着重要作用[9,10]。

miR-145 位于染色体 11p15.5 染色体上AK123483 基因转录生成的非编码 RNA 内含子内，是当前公认的缺氧特异miRNA，是目前科学界公认的一种特异性缺氧miRNA，亦能够在机体缺氧的情况下用于调节血管内皮细胞生成的关键因素[11]。在机体处于缺氧和受 Hif1-a 直接刺激条件下,miR-145 的表达稳定增加,通过抑制 EphrinA3，促进内皮细胞形成血管, 促进血管新生, 能促进VEGF 诱导的HUVECs 迁移,这对促进血管再生有重要作用[12,13]。相关研究发现[14]，尿沉渣中的miRNA具有更好的抗解性，能够在室温下长期储存，甚至能够多次冻融。本研究结果表明，随着冠心病患者NYHA 分级的加重,观察组血清和尿沉渣miR-145 mRNA 含量表达显著下降；患者采用常规方法治疗后，观察组血清和尿沉渣miR-145 mRNA 含量表达显著升高，说明miR-145 的表达受缺氧诱导，调控缺氧反应相关基因的表达,有效提示患者机体内的缺血缺氧性损伤。曾令勇[15]等人亦研究miR-145在心肌梗死大鼠心肌组织中的表达明显下降，上调miR-145 表达可抑制心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡。此外本研究结果亦发现显示，观察组血清及尿沉渣中miR-145 mRNA 含量与患者疾病程度呈明显负相关； 观察组血清及尿沉渣中miR-145 mRNA 含量与患者 TC、LDL-C、CK-MB、CTnl 及 Pro-BNF 含量呈明显负相关，与患者HDL-C 和TG 含量呈明显正相关，说明miR-145 表达与患者的治疗及预后情况明显相关,可有效提示观察组冠心病及冠状动脉粥样硬化的损伤程度。同时，观察组血清miR-145 诊断曲线下面积AUC 为0.78，灵敏度为75.00%, 特异性为80.00%。观察组尿沉渣中miR-145 诊断曲线下面积AUC 为0.64，灵敏度为65.00%, 特异性为72.00%。说明血清和尿沉渣miR-145 在诊断的特异性及敏感性方面有一定的优势,预示着血清和尿沉渣miR-145 可能作为判断冠心病的无创诊断指标。

综上所述,血清和尿沉渣miR-145 可用于作为诊断冠心病的生物学标志物,对于临床判定冠心病患者分期、治疗及复发具有重要的辅助作用。