基于COXⅠ及ITS基因粪类圆线虫PCR鉴定方法的建立

芦亚君，邢维媚，夏乾峰

（海南医学院热带医学与检验医学院，海南 海口 571199）

粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）是一种土源性蠕虫，流行于热带和亚热带地区[1,2]。目前，粪类圆线虫病常用的诊断方法是在患者粪便中检出杆状蚴、丝状蚴或虫卵。在光学显微镜下检获虫体的病原学诊断方法虽然简便快捷,但敏感性和特异性低。粪类圆线虫的虫卵和幼虫均与钩虫、东方毛圆线虫在形态上区别不明显，易混淆[3]。

本研究拟用COXⅠ基因和ITS 基因作为分子标记对粪类圆线虫进行分子生物学鉴定[4]，以明确诊断。以粪类圆线虫病患者的粪便作为检验物纯化粪类圆线虫虫体,提取虫体 DNA，PCR 扩增COXⅠ和ITS 基因，探讨分子鉴定在粪类圆线虫病诊断的应用,为临床上确诊粪类圆线虫感染提供明确的分子生物学依据。

1 材料与方法

1.1 虫体来源 2018 年5 月海南省某医院粪类圆线虫病腹泻患者的粪便。

1.2 试剂 动物组织直接PCR 试剂盒购于北京百泰克生物技术有限公司，2×TSINGKE Master Mix(blue)购于北京擎科新业生物技术有限公司，DL20 00 DNA Marker 购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司、核酸染料GelRed 购于biosharp，引物由广州天一辉远基因科技有限公司合成。

1.3 仪器 高效组织细胞破碎仪购于湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司,小型台式高速冷冻离心机 Eppendorf 5424R、MASTERCYCLER PRO PC R 仪购于 eppendorf（中国）有限公司；L1 型低温连接仪购于珠海黑马医学仪器有限公司,全自动数码凝胶成像分析系统Tanon-1600 购于上海天能科技有限公司。

1.4 形态学鉴别 使用生理盐水直接涂片法检查该腹泻患者粪便，结合病史及临床症状，在光学显微镜下初步鉴定虫种虫期。

1.5 虫体前处理 取患者粪便分装于1.5ml 无菌研磨管内，生理盐水重悬粪便，12000rpm 离心5min，弃上清，重复 3 次[5]。向沉淀加入 100μl AB 溶液和研磨珠置于研磨仪中5000rpm 研磨30s,重复5 次,加入 25μl AD Buffer，室温放置 10min 后，95℃孵育5min,加入100μl AC 溶液后即为虫体粗提物。

1.6 COXⅠ基因PCR 反应 扩增COXⅠ基因的上游引物 ST COI NF：5’-GGTTTATGGGCTGGTATGA-TTG-3’，下游引物 ST COI NR: 5’-AAACCTTAACACCAGTAGGGAC-3’。PCR 体系总体积为20μl：2×PCR Mix 10μl,上游引物、下游引物各 0.8 μl，虫体粗提物 4μl，ddH2O 4.4μl。PCR 反应程序为 94℃预 变性 3min，94℃变 性 1min，48℃退 火1min，72℃延伸 2min,35 个循环,72℃后延伸 10min，反应设置2 个平行。

1.7 ITS 基因PCR 反应 扩增ITS 基因的上游引物NC5：5’ -GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT -3’,下游引物 NC2：5’-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3’[6]。PCR 体系总体积为 50μl：2×Master Mix 25 μl，上游引物、下游引物各 1μl，虫体粗提物 1μl，ddH2O 22μl。梯度 PCR 反应程序为 94℃预变性5min；94℃变性 30s, 退火温度分别设置为 45℃、50℃、55℃、60℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 个循环；72℃后延伸5min，每个反应设置2 个平行。

1.8 电泳 PCR 反应结束后，取 5μl 扩增产物于120V 电压下进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。

2 结果

2.1 形态学鉴定 光镜下观察粪便中的虫体为粪类圆线虫杆状蚴虫期，虫体无色透明、光滑、线状，具有折光性，前端钝圆，尾端尖细，见图1。

图1 粪类圆线虫杆状蚴

2.2 电泳 COXⅠ基因PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外成像系统下观察具有特异性条带，大小约1500bp，见图2。

图2 COXⅠ基因1%琼脂糖凝胶电泳

ITS 基因 PCR 扩增产物在退火温度 45℃、50℃、55℃时有明显的特异性条带，其中50℃目的条带最亮，目的条带大小在900bp 之间。而退火温度是60℃时无目的条带，见图3。

2.3 序列分析 Genebank 中检索显示不同线虫的COXⅠ基因均在1500~1700bp 之间，见表1，而ITS基因在不同线虫中的碱基组成中显示，其分别包括18S、5.8S 和28S 的部分或完全序列，因此碱基长度变化较大，见表2。

3 讨论

图3 ITS基因1%琼脂糖凝胶电泳

表1 不同线虫COXⅠ基因比较

表2 不同线虫ITS基因比较

粪类圆线虫既可以在温暖潮湿的疏松土壤中营自生生活，也可以在宿主体内营寄生生活，是一种致病性兼性寄生虫[7]。粪类圆线虫感染期幼虫丝状蚴经皮肤或口腔黏膜侵入人体后，进入静脉，经过右心进入肺，在肺泡内短暂逗留后沿气管、支气管逆行至咽部，随人的吞咽行为到达胃、小肠，或在体内移行至肠外器官。对于免疫力低下者或者患有恶性肿瘤、长期使用免疫抑制剂、激素等感染者[8,9]，本虫易在体内进行播散性传播或自体感染。虫体若侵犯颅脑、睾丸、腹股沟等部位[10-12]，临床症状不典型、粪便检出率极低、易造成误诊和漏诊,严重患者易致死。据报道，福建、浙江等地均已发现粪类圆线虫致死病例[13,14]。传统的粪类圆线虫病的诊断方法是依靠检验物中检获出虫体,生理盐水直接涂片法镜下进行形态学观察加以判断。其局限性在于粪量的多少、粪便性状、涂片的厚薄及虫体的完整性。另外，钩虫、东方毛圆线虫等线虫与粪类圆线虫具有相似的形态学特征，难以区别，对于确定虫种还需要具有丰富经验的操作人员[15,16]。相比于形态学鉴定法，以粪类圆线虫特异性序列的PCR 技术可提供快速准确的分子诊断依据[17]。

COXⅠ基因是常用的分子遗传标记，广泛应用于物种的鉴定和分类。本研究经PCR 扩增电泳后结果显示，COX I 基因的目的条带约为1500bp，大小符合Genebank 中检索到的其他线虫。ITS 基因扩增使用梯度PCR 方法, 探讨了不同退火温度对产物的影响，发现50℃时目的条带最明显，为最佳退火温度，而60℃无目的条带，说明不同退火温度对ITS 基因的扩增效果存在差别。在Genebank 中检索到不同线虫的ITS 序列，分别包含部分或完全的 18s rRNA、ITS1、5.8s rRNA、ITS2、28s rRNA 基因，因此碱基长度范围较大。但本实验使用ITS 的上、下游引物扩增，其产物由ITS1、5.8s rRNA、ITS2组成，长度约为900bp，符合Genebank 中检索到的序列范围。

本研究探讨了基于COXⅠ及ITS 基因的粪类圆线虫PCR 诊断技术的建立, 并对反应参数进行了优化探讨,为粪类圆线虫病准确及时的临床诊断提供了技术支持，也为该虫的分子分类、基因多态性研究奠定了基础[18]。