抗体药物偶联物药动学研究进展

于丝雨，刘晓东，刘李

（中国药科大学药学院药物代谢研究中心，江苏 南京 211198）

抗体药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC）主要由3 个部分构成，即单克隆抗体（以下简称单抗）、细胞毒性小分子药物（有效载荷）以及抗体-药物连接子。ADC 进入体内后，可特异性与肿瘤细胞上高表达的靶点受体结合，经内化后进入细胞[1]；之后，ADC 被溶酶体捕获，通过连接子的裂解或抗体的降解释放有效载荷，发挥细胞毒作用。部分有效载荷因具有较高亲脂性，可发挥旁观者效应，进入到周围细胞中发挥作用，这种效应对抗原表达阴性的肿瘤细胞十分有效。由上述过程可知，ADC 体内药动学过程比较复杂，因此对于ADC 新药的开发，结合ADC 体内药动学特点全面地研究其疗效的影响因素是必不可少的。本文总结了影响ADC 体内药动学的可能原因、ADC 体内药动学的常用生物分析手段，并为ADC 的体内药动学和药效学的合理预测提供理论参考。

1 抗体药物偶联物作用机制及整体药代动力学

1.1 作用机制

ADC 静脉注射给药后跨血管外渗（肿瘤摄取ADC 的主要限速步骤[2]）进入肿瘤组织间质，在组织内扩散；ADC 的抗体部分可特异性识别肿瘤细胞上高表达的抗原位点并与之结合，诱导ADC 内化进入细胞。构成ADC 的连接子可分为两大类，即裂解型连接子与非裂解型连接子（见表1）。其中，裂解型连接子可在某些特殊化学环境下发生裂解，释放有效载荷，如腙键在低pH 条件下裂解，二硫键在高浓度谷胱氨酸条件下裂解，肽键在蛋白质水解酶作用下裂解，等等；而对于由非裂解型连接子参与构成的ADC，只有当ADC 完全降解时才可释放出仍保留有细胞毒性的连接子-有效载荷复合物，如maleimidocaproyl[3]。释放的有效载荷可与微管蛋白结合，干扰细胞微管网络形成，或与DNA 产生交联，或抑制拓扑异构酶或RNA 聚合酶的活性[1]，进而抑制细胞增殖，诱导细胞死亡。某些有效载荷如免疫毒素的作用机制也包括抑制蛋白质的合成[4]等。除有效载荷的细胞毒作用外，抗体介导的受体信号通路抑制，以及抗体Fc 域或有效载荷介导的免疫反应均可辅助ADC 疗效[2]。

除在肿瘤细胞内，ADC 在循环血液中也有可能发生降解或连接子裂解，释放有效载荷造成全身毒性，某些非肿瘤细胞也可通过非特异性胞吞或Fc受体介导的胞吞作用导致ADC 的内化，产生毒副作用。

表1 全球范围内已批准上市的抗体药物偶联物Table 1 Antibody-drug conjugates approved worldwide

1.2 抗体药物偶联物整体药动学

由于有效载荷的相对分子质量约为裸抗体（相对分子质量约为150 000）的1/150，ADC 的整体药动学特性，如较慢的清除、较长半衰期和限制性组织分布（主要局限于血浆、间质液和淋巴[12]）及蛋白质水解介导的分解代谢[5]，与ADC 的裸抗体药动学行为一致。ADC 解偶联后生成裸抗体和游离有效载荷，而ADC 的降解可生成抗体片段和药物相关代谢物。裸抗体和抗体片段可进一步被蛋白酶水解生成氨基酸。游离有效载荷及其相关代谢物可通过细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶或非CYP450 酶进行代谢（部分保留细胞毒性，部分活性丧失），也可以通过如P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）等转运体转运，最终随粪便排出[13]。大多数ADC 在体内表现出非线性药动学特征：在低剂量时，表现为一级代谢；较高剂量时，一旦靶点饱和，表现为零级代谢。ADC 较长的血浆半衰期一方面归因于新生儿Fc 受体（neonatal Fc receptor，FcRn）的再循环，另一方面原因是ADC 大分子限制了肾小球的滤过作用。

2 影响抗体药物偶联物体内药动学的重要因素

2.1 单抗

影响ADC 药动学的抗体性质包括抗体结构、与抗原结合的亲和力和特异性、Fc 片段依赖的再循环，以及Fcγ 受体（FcγR）蛋白功能等因素。

某些细胞表达的Fc 受体可与抗体Fc 区域结合，调节ADC 的体内分布和消除。与IgG-药物相互作用的Fc 受体是FcRn 和FcγR。每个受体亚型以不同的方式影响ADC 的药动学。血管内皮细胞、巨噬细胞中表达有FcRn，其促进抗体和ADC 跨细胞的内吞转运——在转运过程中，FcRn 作为穿梭蛋白保护ADC 免受溶酶体降解。这种循环有助于延长ADC的血浆半衰期[14]。Fc 区域既是某些抗体与药物连接的位点，也是抗体与FcRn 识别的位点。Acchione等[15]通过热力学分析发现，随着ADC 亲水性增强，ADC 的FcRn 亲和力可能会降低。FcγR 受体存在于单核细胞、粒细胞、抗原提呈细胞等细胞的细胞膜上，它的3 种亚型共同促进免疫系统的抗体依赖功能，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC）和可溶性免疫复合物的消除。ADC 与FcγR 相互作用也可能与ADC 肿瘤微环境的疗效有关：表达FcγR 的肿瘤相关巨噬细胞可能吞噬ADC，并通过旁观者杀伤效应将有效载荷释放到附近的肿瘤细胞。因此，通过改变ADC 与FcRn 受体亲和性可在不影响FcγR受体介导的ADCC 的情况下延长ADC 血浆半衰期，降低清除率。研究人员发现增强抗体与FcγR 的亲和性可延长抗体在灵长类动物体内的血浆半衰期[12,16]。

由于单抗的相对分子质量较大，某些情况下难以透过毛细血管内皮层或由肿瘤细胞间隙进入实质性肿瘤内部，因此，采用具有更强肿瘤穿透能力的抗体片段如Fab、scFv 单链与小分子细胞毒药物构成ADC 是目前的研究热点。此外，非内化ADC（不需要内化进入肿瘤细胞，在肿瘤间质内特定条件下即可释放有效载荷发挥细胞杀伤作用）也是ADC研究热点之一[17]。Dijoseph 等[18]研究发现，对于临床前淋巴瘤模型，由酸不稳定连接子参与构成的ADC 靶向CD20 抗原后虽具有较差的内化性，但连接子可在肿瘤间质内裂解释放有效载荷而发挥作用。其他非内化ADC 还包括放射免疫药物[4]等。

2.2 有效载荷

出于对免疫原性的考虑，目前上市的单抗多为人源化单抗或全人源单抗，但有效载荷的偶联无疑会增加免疫原性风险。由于化学工艺限制，大多数ADC 的药抗比（drug antibody ratio，DAR）不均一，连接子与抗体的结合位点不完全一致。虽然DAR 较高的ADC 具有较高的治疗效能，但更易诱发机体产生抗药物抗体（anti-therapeutic antibody，ATA）[1]即产生免疫原性，导致ADC 清除率及有效载荷脱载率增加，全身毒性加强（产生免疫原性的原因主要有2 个方面，一方面是通过连接子将药物偶联到抗体上可能会在偶联部位产生新表位，导致ADC 与裸抗体相比免疫原性增加。因抗体存在多个连接子偶联位点，因此针对偶联位点形成的ATA 可导致形成巨大的免疫复合物，进而导致免疫细胞的摄取增强。在ADC-ATA 复合物内化后，免疫细胞暴露于有效载荷中并被杀死。另一个可能增强ADC免疫原性的原因是有效载荷的疏水性，其可以产生聚集易发区域，引起免疫原性[19]）。DAR 不仅影响ADC 的清除率、稳定性、有效性、耐受性，还影响ADC 的体内分布和溶剂可达性[20]。临床上ADC 平均DAR 控制在3 到4。体外实验表明随着DAR 增加，ADC 疗效增强；但Lyon 等[3]在一项基于免疫组学的体内分布研究中发现，由抗CD70 抗体h1F6和微管蛋白抑制剂MMAF 以val-cit-PABC（valinecitrulline-p-aminobenzyl carbamate）连接构成的、DAR 为8 的ADC 与h1F6 裸抗体相比，具有更深、更广泛的肝组织细胞染色，表明高DAR 的ADC 具有更强的肝摄取和更高的清除率。这是由于高DAR的ADC 药物具有更高的疏水性，易引起聚集和免疫原性的产生以及肝摄取的增加和肝毒性的增强，此时采用亲水性较强的连接子，可保证高DAR 的ADC 疗效在体内仍然保留。Yurkovetskiy 等[21]基于强亲水性多价多聚物聚-1-羟基甲基乙基羟甲基甲醛（poly-1-hydroxymethylethylene hydroxymethyl，PHF）研制了曲妥珠单抗-PHF-vinca ADC，允许DAR 高达20 而不会对ADC 的药动学特性产生影响。Li 等[22]制备了一种二价双聚抗体ADC，通过同时与HER2 阳性细胞上2 个非重叠表位结合，增强ADC 内化和溶酶体的捕获。

有效载荷的较高膜通透性有助于旁观者效应的产生，利于药物的肿瘤分布，特别是对于靶点表达水平异质化的肿瘤组织。但随着时间推移，表达靶点的细胞被杀死，异质肿瘤中的旁观者效应变得不再那么突出。低膜通透性也可能是有益的，连接子在循环中可能发生降解或有效载荷的自发解离，若游离有效载荷很容易进入细胞，则会对正常组织产生毒性[23-24]。

最新ADC 相关研究主要集中于采用新技术消除ADC 异质性和开发新型有效载荷以提高有效载荷稳定性和ADC 疗效[25]。下一代ADC 努力集中在应用定点偶联技术（包括采用赖氨酸和半胱氨酸偶联、引入非天然氨基酸、N-糖修饰以及微生物谷氨酰胺酶参与转肽反应等[1,26]）制备ADC。如Kristensen等[27]采用β-半乳糖苷酶和糖苷内切酶S2 对曲妥珠单抗进行糖基化修饰，然后定点偶联p-SCN-Bn-去铁胺得到ADC，其与随机偶联形成的异质化ADC 相比，在HER2 阳性卵巢腺癌SK-OV-3 小鼠体内显示出更高的体内稳定性、肿瘤摄取率和免疫反应性。但同时应注意，ADC 修饰也必然会引起包括组织分布在内的一系列药动学性质的改变[28]。

2.3 连接子

连接子共价连接单抗和有效载荷，其分子结构与特性可直接对ADC 的药动学和药效学及治疗窗产生影响。连接子必须保证在血液循环中十分稳定，而一旦经内化进入肿瘤细胞内，又能快速裂解释放有效载荷。

2.3.1 抗体-连接子偶联位点 偶联位点差异可通过改变溶剂可达性和偶联位点局部电荷影响ADC 的药动学性质和疗效[29]。研究中通常采用溶剂可达分数（fractional solvent accessibility，FSA）来估计溶剂对给定氨基酸残基的可达性。FSA 接近0 表示溶剂难以到达氨基酸残基。一般抗体上具有8 个可用的半胱氨酸残基和约80 个赖氨酸残基[30]。Su 等[25]结合3D-抗体结构图像发现，结合于抗体β-sheet 区[LCK149C（FSA = 8.9）与HC-A140C（FSA = 15.5）结合位点]的有效载荷比结合于loop 区[HC-A118C（FSA = 33.0）结合位点]具有更低的FSA 值、更高的稳定性，表明抗体在偶联位点处的局部结构所提供的空间位阻在一定程度上可提高有效载荷稳定性。此外，连接子与抗体偶联位点的局部阳离子环境也可增强ADC 在循环中的稳定性[13]。

偶联位点也可能影响ADC 的疏水性，即所结合多个疏水性有效载荷可能在抗体铰链区内源性配对的半胱氨酸残基处彼此接近构成“疏水补丁”，导致ADC 疏水性增强[20,31]，清除加快。

2.3.2 连接子修饰 连接子分子链长度在一定程度下可调节载荷代谢，较短连接子分子参与偶联的ADC的有效载荷在循环血液中具有更高的稳定性。因此，连接子的修饰可通过协助偶联位点的调节共同提高有效载荷在循环中的稳定性。采用较短的连接子可将有效载荷定位在高空间位阻的偶联位点附近，降低有效载荷溶剂可达性，提高其稳定性。有效载荷的循环稳定性也与不同物种所含有的代谢酶、静电环境等相关[25]。

2.4 靶点

靶点的多种特性影响ADC 的体内分布，统称为靶点介导的药物分布（target-mediated drug disposition，TMDD）。靶点的表达水平、内化速率及周转速率、靶点可达性，以及与抗体的亲和性均对ADC 的体内分布及药效有重要影响[32]。

结合位点屏障效应是指实质性肿瘤细胞上过高的抗原表达导致肿瘤血管周围细胞内有效载荷浓度远远高于细胞死亡所需水平，而深层肿瘤细胞内几乎不存在有效载荷，达不到杀伤作用的现象。结合位点屏障效应与靶点表达、周转和ADC-靶点结合亲和力有关，这种效应可阻碍ADC 在整个实体肿瘤中的渗透。在肿瘤组织中，高亲和力的ADC 抗体更有可能与第一个可用的靶点结合，而不是分布到更远的靶点。因此需调节ADC 靶向亲和力——既保证ADC 能够在实质肿瘤内较均匀地分布，也要保证ADC 能够充分内化发挥细胞毒作用[2]。许多研究表明，同时给予或先给予临床剂量的裸抗体，裸抗体通过与ADC 竞争相同的靶点，提高ADC 肿瘤渗透性，降低“结合位点屏障效应”[33]；同时裸抗体可结合非肿瘤细胞上的低水平表达靶点，降低ADC造成的全身毒副作用。Boswell 等[33]预先给予前列腺癌荷瘤小鼠TENB2 抗体，再给予antiTENB2-MMAE，发现可在不影响肿瘤治疗效果的前提下显著降低ADC 的正常组织摄取。细胞堆叠和细胞间紧密连接也可能限制细胞膜上靶点的可达性；如果靶点形成二聚体或寡聚体，阻碍或隐蔽抗体结合域，则靶点可达性也会受到阻碍。有研究发现，减小ADC 分子大小、减缓内化速率可促进ADC 的肿瘤渗透[12]，这些因素对于建立ADC 药动学模型十分重要。

有研究表明，循环中存在的可溶性或脱落抗原如膜结合靶点的细胞外结构域（extracellular domain，ECD）可与ADC 结合形成免疫复合物[34]。ECD 常存在于肿瘤靶点过度表达的患者的循环中。研究表明ECD 脱落速率受靶点表达水平和内化速率的影响，Pool 等[34]研究发现与表皮生长因子受体的ECD 结合的ADC 抗体可在肝脏中堆积，因此，针对血浆ECD 水平较高的靶点的ADC 可能具有更高的肝毒性和更低的肿瘤组织分布。

2.5 其他

2.5.1 外排转运体 细胞多药耐药基因1（multidrug resistance 1，MDR1） 的 表 达 产 物P- 糖 蛋 白（P-glycoprotein，P-gp）介导的多药耐药性也将影响ADC 疗效[35]，市面绝大多数有效载荷是P-gp 的底物。研究表明，因非极性药物更易被P-gp 外排至细胞外，因此可通过增加连接子的亲水性以增加连接子-有效载荷复合物的极性，或同时给药P-gp 底物药物如维拉帕米，竞争性抑制P-gp 介导的药物外排。Toppmeyer 等[36]研究表明，人白血病U937细胞上存在的多药耐药基因表型可对细胞毒多肽dolastatin 10 产生交叉耐药性，而合用维拉帕米则可逆转U937 细胞对dolastatin 10 的抗性。

2.5.2 肿瘤微环境 肿瘤组织间往往存在低氧区和酸性间质液，连接子稳定性可能变差。其中pH 的改变也可能影响ADC 与靶点的结合。如前所述，Dijoseph 等[18]研究表明，通过规避ADC 靶向CD20抗原后内化差的缺点，利用肿瘤间质的低pH 环境，可提高酸不稳定连接子参与构成的ADC 的效能。

3 抗体药物偶联物生物分析方法

ADC 生物分析包括对ADC 在体循环内、肿瘤内、细胞内的药动学、药效学、毒代动力学进行全面的评价。测定血液/血浆/血清中ADC 的浓度是合理评估其体内药动学、药效学的必要条件。通常可以采用配体结合实验（ligand-binding assay，LBA）、LC-MS 结合免疫沉淀法[19]检测总抗体、结合型抗体、裸抗体、抗体结合型药物浓度水平及进行抗ADC 的ATA 分析。可裂解连接子构成的ADC 也可采用LC-MS/MS 结合微波辅助蛋白酶解法对ADC 多种代谢物水平进行分析[37]。游离有效载荷也可采用三重四极杆质谱与高效液相色谱或超高效液相色谱相结合的技术进行分析[19]。

ADC 生物分析的挑战来自ADC 的异质性及其复杂的体内行为，导致需要对大量的分析物进行检测。如ADC 的生物转化引起DAR 动态变化，产生一系列代谢物、连接子片段、连接子-药物复合物，或与内源性物质白蛋白、半胱氨酸等形成加合物，或与ECD 形成复合物或发生蛋白质的交换（如IgG4Fab-arm 交换）[2]等等。目前常用的检测工具包括LC-MS/MS、高分辨率质谱、亲和质谱、疏水色谱、MALDI/MS 等[13,38-42]。此外，通过放射性标记ADC（标记抗体或有效载荷），可根据放射性的强弱检测组织ADC 含量，如采用125I 标记的抗体研究ADC 组织摄取、采用111In-DOTA 标记的抗体作为带电的强极性探针研究ADC 内化情况。也可采用放射性标记（3H 或14C）有效载荷，检测有效载荷的组织分布，辅助判断ADC 的疗效及全身性毒性等[29]。其他无创分子成像技术包括单光子发射计算机断层扫描（89Zr、111In 标记抗体）和正电子发射断层扫描（采用64Cu、86Y、89Zr 或124I 标记ADC）等[43]。

此外，由于不同种属的特定抗原表达、ADC 与FcRn 的亲和性等存在差异，且还需考虑ADC 在不同种属内的连接子稳定性、代谢过程差异，因此，研究种属间ADC 代谢物或降解物的差异十分重要，以确保临床前研究可以通过ADC 在动物体内的药动学数据合理推算预测人体药动学行为。

4 体外药动学与药效学模型预测抗体药物偶联物体内过程

体外生理药动学模型可协助预测ADC 临床药动学和药效，确定多剂量给药的合理给药方案，从而使疗效最大化、毒副作用最小化[44-45]。从简单的单房室、二房室、三房室模型到基于生理的生理药动学模型，可以通过逐步引入体内ADC 去共轭、代谢、清除等相关参数，建立完善的体外药动学-药效学模型。采用药动学-药效学模型不仅可以模拟ADC 和游离有效载荷在体内的吸收、分布、代谢和排泄，还可预测ADC 的安全性。

4.1 药动学模型

机制性药动学模型可预测ADC 多种代谢物的药动学进程。Byun 等[46]根据ADC brentuximab vedotin 构建了一个同时考虑了抗体靶点和有效载荷受体（微管蛋白）的机制性药动学模型，并用于研究ADC 在体药动学特性。该模型还可通过半衰期来预测ADC 和有效载荷的AUC。更复杂的药动学模型即建立一个多维的药动学模型——将全身器官水平ADC 分布与肿瘤组织ADC 分布模型联系起来。群体药动学模型可结合协变量模型和统计模型，描述人群间及个体内的药动学差异。

因肿瘤静态血药浓度（tumor static concentration，TSC）远高于循环血药浓度[47]，预测肿瘤细胞内药物摄取和分布对于后续药动学-药效学建模十分必要。Singh 等[48]描述了一个ADC 细胞分布模型，其包括更多的细胞内细节，如ADC 降解和ADC 在肿瘤细胞中的被动扩散及离开细胞。他们的分析表明，ADC 的解偶联，以及游离有效载荷通过肿瘤细胞膜的被动扩散是影响细胞内药物暴露水平的关键因素。Singh 等[38]建立了trastuzumab-valinecitrulline-monomethyl auristatin E（T-vc-MMAE） 的单细胞药动学-药效学模型，该模型不仅可以很好地预测MMAE 的内流（如旁观者效应）、外排速率，以及ADC 胞内降解速率等参数，还能通过敏感分析预测出ADC 的内化、降解速率，靶点HER2 表达水平、MMAE 的外排速率是影响ADC 胞内暴露量的主要因素。此外，更完善的药动学模型建立也需考虑和预测FcRn 再循环、TMDD、药物间相互作用、免疫原性等因素[5]。

4.2 药效学模型

由于ADC 在细胞内存在复杂的药动学行为，因此肿瘤摄取药量并不等同于起效药量[49]。构建药动学-药效学模型的核心在于将ADC 肿瘤内暴露量转化为ADC 疗效。Shah 等[50]通过建立药动学-药效学模型，将体内与体外的ADC 效能相关联，建立了ADC 体内、体外相关性（IVIVC），用于根据体外ADC 数据预测体内ADC 产生疗效的最低剂量，辅助优化临床前效能实验设计。Singh 等[48]描述了一种细胞周期模型，其可用于表征ADC 对处于不同细胞周期的细胞群体的影响，为肿瘤细胞的生长抑制情况提供相关预测；当其与药动学模型相结合，可用来估计细胞内药物浓度，预测药物疗效。但对于非裂解型连接子参与构成的ADC，其在溶酶体内降解产生的连接子-有效载荷复合物可能不能经扩散透过溶酶体膜进入细胞质中，而是更多地依赖于离子转运体。因此，在评价药物对肿瘤细胞的疗效时，应考虑这些转运体的表达和活性[2]。实际上，ADC的作用机制也包含其他免疫反应机制，但由于人们建模存在局限，很难在模型中体现出来[2,48]。

通常可采用多房室转运的毒代动力学模型预测ADC 毒性。Bender 等[51]报道了一种包含转运室的半机制性群体毒代动力学模型，用于模拟单剂量给予ADC trastuzumab emtansine 后血小板的发育和循环过程，以预测不良反应严重程度。

5 结语

ADC 临床药动学行为绝非抗体或细胞毒药物药动学的简单加和，其复杂的体内药动学行为正是ADC 药物研发的主要着力点，同时也对该类药物的定性、定量分析提出了新的要求。通过多方面的研究全面详实地掌握影响ADC 体内药动学过程和药效的诸多因素，不仅可为ADC 的分子设计和结构优化提供新思路，还可为ADC 的药动学-药效学模型或毒代动力学模型的合理构建提供更充分的信息。但由于模型构建仍存在局限，ADC 部分体内过程无法在模型中体现出来，未来还需进一步的研究和探索。