曲马多下调miR-574-5p对胃癌细胞增殖及凋亡的影响机制研究

范瑷霞

胃癌是临床常见恶性肿瘤之一，我国胃癌发病率与死亡率较高，目前临床主要采用手术的方式治疗胃癌，但麻醉药物等均可影响治疗效果[1,2]。研究表明曲马多(Tramadol)可通过调控免疫因子表达从而影响胃癌患者的免疫功能[3,4]。曲马多可减轻肿瘤患者中前炎因子水平而抑制应激反应[5]。但曲马多对胃癌细胞生物学行为的影响尚未完全阐明。研究表明微小RNA-574-5p(microRNA-574-5p，miR-574-5p)在胃癌组织中高表达，其表达水平与肿瘤大小、TNM分期等临床参数密切相关[6]。研究表明miR-574-5p在多种恶性肿瘤中高表达，还可促进宫颈癌细胞增殖及抑制其凋亡[7,8]。但曲马多是否可通过调控miR-574-5p表达而发挥作用尚未可知。本研究以人胃癌SGC-7901细胞为研究对象，观察曲马多对胃癌SGC-7901细胞增殖及凋亡的影响，及其对miR-574-5p表达的调控作用，进一步探讨其内在作用机制，旨在为曲马多用于治疗胃癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 曲马多购自德国格兰泰有限公司；胃癌SGC-7901细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。miR-574-5p inhibitor、Inhibitor control、miR-574-5p mimic、mimic control购自广州锐博生物科技有限公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清购自上海远慕生物科技有限公司；青霉素与链霉素购自上海信帆生物科技有限公司；Lipofectamine2000购自上海润成生物科技有限公司；MTT购自北京博润莱特科技有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；RIPA裂解液购自南京森贝咖生物科技有限公司；Trizol试剂购自美国Thermo Fisher公司；反转录与实时荧光定量PCR试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；B淋巴细胞瘤2(Bcl2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)单克隆抗体购自上海钰博生物科技有限公司；HRP标记的IgG二抗购自武汉艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验处理与分组:胃癌SGC-7901细胞贴壁培养于RPMI 1640完全培养基，含有10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素以及链霉素(0.1 mg/ml)，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养，每隔2 d更换1次培养液，待细胞汇合至90%，弃上清，0.25 %胰蛋白酶消化1 min，加入RPMI 1640完全培养基(5 ml)，反复吹打至细胞脱落，收集细胞，1 000 r/min的转速离心5 min后弃上清(重复2次)，加入RPMI 1640完全培养基(10 ml)重悬细胞，传代培养。取SGC-7901单细胞悬液接种于24孔板(1.5×105个/孔)，实验分组：Tramadol 3 μg/ml组、Tramadol 30 μg/ml组、Tramadol 300 μg/ml组。MTT检测细胞吸光度值，筛选Tramadol 300 μg/ml进行后续研究。实验细胞转染：胃癌SGC-7901细胞分别转染Inhibitor control(Inhibitor control组)、miR-574-5p inhibitor(miR-574-5p inhibitor组)，转染前1 h更换为不含血清及双抗的RPMI 1640培养基，转染后6 h，更换为含有血清及双抗的RPMI 1640完全培养基，继续培养48 h。后续研究中将转染miR-574-5p mimic、mimic control的胃癌SGC-7901细胞，实验分组：Tramadol+mimic control组、Tramadol+miR-574-5p mimic组。

1.2.2 MTT检测细胞增殖:收集4组SGC-7901细胞，胰蛋白酶消化，制备细胞悬液，调整细胞密度(3×105个/ml)，每孔加入100 μl细胞悬液接种于96孔板，加入20 μl MTT溶液，继续培养4 h，弃上清液，每孔分别加入150 μl DMSO溶液，低速振荡混匀，应用酶标仪检测各孔吸光度值(A)。每组实验均设置3次重复。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率:取各组对数生长期SGC-7901细胞，预冷PBS洗涤，胰蛋白酶消化，1 000 r/min转速离心5 min，PBS洗涤，加入100 μl结合缓冲液，依次分别加入5 μl Annexin V-FITC与PI，室温避光孵育20 min，各流式管内分别加入400 μl结合缓冲液，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 qRT-PCR检测细胞中miR-574-5p表达水平:取各组SGC-7901细胞，按照Trizol法提取细胞总RNA，利用紫外分光光度计检测RNA浓度，置于-80℃超低温冰箱保存待测。反转录：根据反转录试剂盒说明书配置反应体系，严格按照试剂盒说明书进行操作，RNA经反转录得到cDNA。qRT-PCR反应：参照试剂盒说明书配置反应体系20 μl，应用ABI 7500荧光定量PCR仪检测miR-574-5p的Ct值；反应条件：95℃ 2 min(1×)，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s(35×)。miR-574-5p以U6为内参，采用 2-ΔΔCt法计算miR-574-5p相对表达量。

1.2.5 蛋白免疫吸附法(Western blot)检测Bax、Bcl2蛋白表达:取各组SGC-7901细胞，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法定量蛋白，应用RIPA裂解液调整蛋白浓度(60 μg/μl)，高温煮沸5 min(99℃)蛋白变性，取10 μl变性蛋白根据分组加入不同泳道内，经SDS-PAGE凝胶电泳反应，待溴酚蓝至凝胶底部边缘时将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜，取PVDF膜放入含有5%脱脂奶粉中封闭1 h，加入一抗稀释液(1∶500)，4℃孵育24 h，TBST洗膜，加入二抗稀释液(1∶2 000)，4℃孵育1 h，TBST洗膜，滴加ECL化学发光剂，曝光，利用凝胶成像系统及ImageJ软件检测条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 曲马多对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响 用不同浓度的曲马多处理胃癌细胞，与Control组比较，Tramadol 3 μg/ml组、Tramadol 30 μg/ml组、Tramadol 300 μg/ml组胃癌SGC-7901细胞增殖能力显著降低(P<0.05)。选用曲马多浓度300 μg/ml进行后续实验。见表1。

2.2 曲马多对SGC-7901细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示，与Control组比较，Tramadol组SGC-7901细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。Western blot检测结果显示，与Control组比较，Sevoflurane组SGC-7901细胞中Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，Bcl2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图1、2，表2。

表1 不同浓度曲马多对SGC-7901细胞增殖的影响

图1 曲马多对SGC-7901细胞凋亡的影响

图2 Western blot检测曲马多对SGC-7901细胞凋亡相关蛋白表达的影响;A Control；B Tramadol

表2 曲马多对SGC-7901细胞凋亡的影响

2.3 曲马多对SGC-7901细胞中miR-574-5p表达的影响 qRT-PCR检测结果显示，与Control组比较，Tramadol组SGC-7901细胞中miR-574-5p的表达水平显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 qRT-PCR检测曲马多对SGC-7901细胞中miR-574-5p表达的影响

2.4 miR-574-5p对SGC-7901细胞增殖及凋亡的影响 实验结果显示，与Inhibitor control组比较，miR-574-5p inhibitor组SGC-7901细胞增殖能力显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，Bcl2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图3，表4。

图3 抑制miR-574-5p的表达对SGC-7901细胞凋亡相关蛋白表达的影响；A Inhibitor control;B miR-574-5p inhibitor

表4 抑制miR-574-5p的表达对SGC-7901细胞增殖及凋亡的影响

2.5 miR-574-5p阻断曲马多对SGC-7901细胞的抑制 与Tramadol+mimic control组比较，Tramadol+miR-574-5p mimic组SGC-7901细胞增殖能力显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著减低(P<0.05)，Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，Bcl2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见表5，图4。

3 讨论

近年来，随着现代生活节奏的加快，胃癌发病率呈上升趋势，针对胃癌的治疗方式较多，而辅助药物在治疗过程中扮演重要角色，如何抑制围手术期胃癌细胞迁移及侵袭成为研究重点[9,10]。因此本研究主要探究曲马多对胃癌细胞增殖及凋亡的影响及其内在作用机制。

表5 过表达miR-574-5p阻断曲马多对SGC-7901细胞的抑制

图4 Western blot检测SGC-7901细胞中凋亡相关蛋白表达量；A Tramadol；B Tramadol+mimic control；C Tramadol+miR-574-5p mimic

曲马多通过α2-肾上腺素受体信号传导抑制乳腺癌细胞的增殖，迁移及侵袭[11]。曲马多影响结肠癌细胞系代谢变化[12]。曲马多还可减轻胶质瘤细胞诱导的大鼠股骨癌疼痛程度[13]。曲马多通过PTEN/ PI3K/ AKT信号传导抑制肺腺癌细胞的增殖，迁移及侵袭[14]。本研究通过采用不同浓度的曲马多处理胃癌细胞，结果显示细胞增殖能力显著降低，细胞凋亡率显著升高，提示曲马多可抑制胃癌细胞增殖及促进其凋亡。研究表明细胞凋亡相关基因Bax在胃癌组织中呈低表达，而Bcl2的表达水平升高，Bax可与Bcl2结合形成二聚体从而抑制Bcl2表达，Bcl2可抑制细胞凋亡，而Bax可通过激活线粒体途径促进细胞凋亡[15,16]。本研究结果显示曲马多处理后，胃癌细胞中Bax的表达水平升高，Bcl2的表达水平降低，提示曲马多可能通过促进Bax表达及抑制Bcl2表达从而促进胃癌细胞凋亡。

miR-574-5p在肺癌组织中呈高表达，抑制miR-574-5p表达可抑制肺癌恶性进展[17]。研究表明miR-574-5p可通过靶向PTPRU而促进非小细胞肺癌转移[18]。LncRNA PTCSC3 在甲状腺乳头状癌细胞中呈低表达，上调其表达可抑制miR-574-5p表达从而抑制Wnt/β-Catenin信号通路激活进而抑制肿瘤细胞增殖及迁移[19]。本研究结果显示曲马多处理后，胃癌细胞中miR-574-5p的表达水平显著降低，进一步研究显示抑制miR-574-5p表达可显著降低胃癌细胞增殖能力，促进细胞凋亡。提示曲马多可能通过下调miR-574-5p的表达而抑制胃癌细胞增殖及促进其凋亡。本研究进一步证实miR-574-5p过表达后可明显逆转曲马多对胃癌细胞增殖及凋亡的作用。提示曲马多可通过抑制miR-574-5p的表达从而降低胃癌细胞增殖能力，诱导细胞凋亡。

综上所述，曲马多可抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡，其作用机制与下调miR-574-5p的表达，抑制Bcl2蛋白表达及促进Bax蛋白表达有关，为曲马多对胃癌细胞增殖与凋亡的影响的分子机制探究提供实验依据。本研究存在不足之处，关于曲马多对胃癌细胞迁移及侵袭等其他生物学行为的影响尚未可知，同时胃癌细胞增殖与凋亡程中miR-574-5p对下游靶基因及其他相关信号通路的调控作用仍需进一步研究。