miR-1260a调控FEZ1对前列腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

孙彦申 张跃

前列腺癌是临床常见恶性肿瘤之一，调查显示我国前列腺癌发病率逐年上升，前列腺癌发生发展与致癌基因、抑癌基因等异常表达密切相关[1,2]。微小RNA(microRNA，miRNA)可通过与靶mRNA结合从而参与癌症、心血管疾病等多种疾病发生过程[3,4]。因而探究前列腺癌发生发展的原因及引起的机制对提高治疗效果具有重要意义。研究表明，微小RNA-1260a(microRNA-1260a，miR-1260a)在前列腺患者中高表达[5]。但miR-1260a对前列腺癌细胞生物学行为的影响尚未见报道。TargetScan预测显示亮氨酸拉链蛋白(fasciculation and elongation protein zeta-1，FEZ1)可能是miR-1260a的靶基因，研究表明，miR-1260a是一个抑癌基因并可抑制肿瘤增殖[6]。研究报道指出，FEZ1过表达可诱导前列腺癌细胞凋亡及抑制增殖[7]。但miR-1260a是否通过调控FEZ1的表达影响前列腺癌细胞生物学行为尚未可知。本研究主要探讨miR-1260a对前列腺癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响及机制，分析其对FEZ1的调控作用，以期为前列腺癌的分子诊断及靶向治疗提供新的治疗方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年6月至2019年1月于本院诊治的前列腺癌患者46例为研究对象，患者均经病理证实为前列腺癌，年龄50～70岁，平均年龄(65.25±5.64)岁，所有患者接受手术治疗，术前均未接受放疗或化疗，本研究经本院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。术中切除前列腺癌组织及其癌旁组织，放入液氮中保存，术后转移至-80℃超低温冰箱保存。

1.2 材料与试剂 前列腺癌DU145细胞购自美国ATCC细胞库。杜氏改良培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)、胰蛋白酶、胎牛血清均购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000购自美国Thermo Fisher Scientific公司；miR-1260a特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-1260a)及其阴性对照(anti-miR-NC)、miR-1260a模拟物(mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、FEZ1小干扰RNA(si-FEZ1)、无意义阴性序列(si-NC)均购自广州锐博生物科技有限公司；Trizol、反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒购自日本TaKaRa公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；细胞凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Mgtrigel基质胶购自美国BD公司；蛋白裂解液与二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；兔抗人细胞周期蛋白1(CyclinD1)、B淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、P21、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、上皮钙黏附素(E-cadherin)抗体购自美国CST公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染及分组:前列腺癌DU145细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基，培养条件：37℃、5%CO2，收集对数生长期DU145细胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培养基制备细胞悬液种于24孔板，待细胞生长融合至70%时进行转染，参照Lipofectamine2000转染说明书进行操作，实验分组：anti-miR-NC组(anti-miR-NC转染至DU145细胞)、anti-miR-1260a组(anti-miR-1260a转染至DU145细胞)、anti-miR-1260a+si-NC组(anti-miR-1260a与si-NC共转染至DU145细胞)、anti-miR-1260a+si-FEZ1组(anti-miR-1260a与si-FEZ1共转染至DU145细胞)。为探究miR-1260a靶向调控FEZ1的表达，实验分组：miR-NC组(miR-NC转染至DU145细胞)、miR-1260a组(miR-1260a mimics转染至DU145细胞)、anti-miR-NC组(anti-miR-NC转染至DU145细胞)、anti-miR-1260a组(anti-miR-1260a转染至DU145细胞)。4组细胞转染6 h后更换为含有10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48 h收集细胞。

1.3.2 实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)检测细胞中miR-1260a的表达水平:取出冻存前列腺癌组织与癌旁组织及各组细胞，采用Trizol法提取总RNA，按照反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，miR-1260a正向引物5’-ATCCCACCTCTGCCACCA-3’，反向引物：5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；U6正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司。以cDNA为模板进行qRT-PCR反应，参照试剂盒配置反应体系，反应条件：95℃ 2 min(循环1次)，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s(循环40次)。miR-1260a以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-1260a的相对表达量。

1.3.3 MTT检测细胞增殖:收集4组对数生长期DU145细胞，胰蛋白酶消化，加入培养基制备单细胞悬液，调整细胞密度为3×104个/ml，按照每孔100 μl细胞悬液接种于96孔板，分别于转染24、48、72 h时每孔中加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，室温孵育4 h，弃上清，每孔分别加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，置于振荡仪低速振荡10 min，应用酶标仪检测各孔光密度值(OD 490 nm)，以OD值大小表示细胞活力。

1.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡:取4组对数生长期DU145细胞，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，室温条件下1 000 r/min转速离心6 min，弃上清，预冷PBS清洗，加入500 μl结合缓冲液，加入5 μl膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)，充分混匀，加入5 μl碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)，室温避光孵育10 min，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.5 Transwell实验检测细胞迁移:取对数生长期DU145细胞，弃上清，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含血清的DMEM培养液制备单细胞悬液，调整细胞密度至5×104个/ml，按照每孔200 μl将细胞悬液接种于Transwell小室的上室，取600 μl含有10%胎牛血清的培养液加入Transwell小室的下室，放入37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养24 h，PBS洗涤，多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤，0.1%结晶紫染液染色10 min，擦拭未迁移细胞，显微镜下随机选取5个视野观察迁移细胞数。

1.3.6 Transwell实验检测细胞侵袭:预备实验：预冷培养液稀释Matrigel基质胶(9∶1)，按照每孔加入40 μl Matrigel稀释液，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育5 h。实验步骤：取对数生长期DU145细胞，弃培养液，PBS洗涤，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含胎牛血清的培养液制备单细胞悬液，调整细胞密度至5×104个/ml，按照每孔200 μl单细胞悬液加入Transwell小室的上室，取600 μl含有10%胎牛血清的培养液加入Transwell小室的下室，37℃恒温培养箱内培养24 h，PBS洗涤，多聚甲醛固定10 min，0.1%结晶紫染液染色10 min，擦去未侵袭细胞，显微镜下随机选取5个视野观察侵袭细胞数。

1.3.7 双荧光素酶报告基因检测:TargetScan预测显示miR-1260a与FEZ1存在结合位点，将结合位点及突变位点载入荧光素酶报告基因载体构建野生型载体WT-FEZ1、突变型载体MUT-FEZ1，取对数生长期DU145细胞，实验分为4组：WT-FEZ1与miR-NC共转染组、WT-FEZ1与miR-1260a mimics共转染组、MUT-FEZ1与miR-NC共转染组、MUT-FEZ1与miR-1260a mimics共转染组，继续培养24 h，检测4组相对荧光素酶活性。

1.3.8 蛋白免疫印迹(Western blot)检测Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、P21、Bax、E-cadherin、FEZ1蛋白表达:收集4组DU145细胞，加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，取30 μg变性蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜，采用5%脱脂奶粉封闭2 h，室温条件下孵育一抗稀释液，4℃孵育过夜，TBST洗涤，孵育二抗稀释液(1∶2 000)，室温条件下孵育1 h，TBST洗涤，曝光，显影，应用凝胶成像分析系统及ImageJ软件分析各条带灰度值。

2 结果

2.1 miR-1260a在前列腺癌组织和癌旁组织中的表达 与癌旁组织比较，前列腺癌组织中miR-1260a的表达水平显著升高(P<0.01)。见表1。

表1 miR-1260a在前列腺癌组织和癌旁组织中的表达

2.2 抑制miR-1260a对细胞DU145增殖、凋亡的影响 与anti-miR-NC组比较，anti-miR-1260a组前列腺癌DU145细胞中miR-1260a的表达水平显著降低(P<0.01)，细胞活力显著降低(P<0.01)，细胞凋亡率显著升高(P<0.01)，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，P21、Bax蛋白表达量显著升高(P<0.01)。见图1，表2、3。

图1 抑制miR-1260a对细胞DU145增殖、凋亡的影响;A 抑制miR-1260a对细胞DU145凋亡的影响;B 抑制miR-1260a对细胞DU145增殖、凋亡蛋白表达的影响

表2 抑制miR-1260a对细胞DU145增殖的影响

表3 抑制miR-1260a对细胞DU145凋亡的影响

2.3 抑制miR-1260a对细胞迁移、侵袭的影响 与anti-miR-NC组比较，anti-miR-1260a组迁移与侵袭细胞数显著减少(P<0.01)，MMP-2蛋白表表达量显著降低(P<0.01)，E-cadherin蛋白表达量显著升高(P<0.01)。见表4，图2。

表4 抑制miR-1260a对细胞迁移、侵袭的影响

图2 抑制miR-1260a对细胞迁移、侵袭蛋白表达的影响

2.4 miR-1260a靶向、调控FEZ1的表达 TargetScan预测显示FEZ1的3’UTR含有miR-1260a的互补序列。双荧光素酶报告实验结果显示，转染克隆有FEZ1-3’UTR突变型载体质粒实验中，miR-1260a组与miR-NC组比较，荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)；转染克隆有FEZ1-3’UTR载体质粒实验中，miR-1260a组荧光素酶活性明显受到抑制，与miR-NC组比较，荧光素酶活性差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测结果显示，与miR-NC组比较，miR-1260a组DU145细胞中FEZ1蛋白表达量显著降低(P<0.01)；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-1260a组DU145细胞中FEZ1蛋白表达量显著升高(P<0.01)。表明miR-1260a可靶向调控FEZ1的表达。见表5、6，图3。

表5 双荧光素酶报告实验

表6 miR-1260a调控FEZ1的表达

图3 miR-1260a靶向、调控FEZ1;A FEZ1的3’UTR含有miR-1260a的互补序列；B miR-1260a调控FEZ1的表达

2.5 抑制FEZ1能逆转抑制miR-1260a对细胞DU145增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响 与anti-miR-1260a+si-NC组比较，anti-miR-1260a+si-FEZ1组DU145细胞活力显著升高(P<0.01)，细胞凋亡率显著降低(P<0.01)，迁移与侵袭细胞数显著增加(P<0.01)，Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2蛋白表达量显著升高(P<0.01)，P21、Bax、E-cadherin蛋白表达量显著降低(P<0.01)。见表7、8，图4。

表7 抑制FEZ1能逆转抑制miR-1260a对细胞DU145增殖蛋白表达的影响

表8 抑制FEZ1能逆转抑制miR-1260a对细胞DU145凋亡、迁移、侵袭的影响

图4 抑制FEZ1能逆转抑制miR-1260a对细胞DU145增殖的影响

3 讨论

前列腺癌早期诊断方法主要为直肠指检、前列腺癌特异性抗原等，肿瘤分期等可作为判断患者预后的主要指标，但仅依靠临床病理指标不可准确评估前列腺癌患者预后[8]。因而积极探寻敏感性与特异性较高的分子标志物可为前列腺癌靶向治疗提供实验依据。既往研究显示miR-214、miR-188-5p等miRNA在前列腺癌中异常表达，并可影响前列腺癌细胞增殖、迁移等生物学行为[9,10]。但仍有部分miRNA在前列腺癌发生及转移过程中的作用机制尚未完全阐明。

miR-1260a在黑色素瘤等多种肿瘤中均呈高表达，并可能影响肿瘤发生发展进程[11,12]。但miR-1260a在前列腺癌发生及转移过程中的作用机制尚未可知。本研究结果显示前列腺癌组织中miR-1260a的表达水平显著升高，提示miR-1260a的表达水平升高可能促进前列腺癌的发生。本研究通过体外细胞实验，以前列腺癌DU145细胞为研究对象，检测抑制miR-1260a的表达对DU145细胞生物学行为的影响，结果显示抑制miR-1260a的表达可显著降低DU145细胞活力，说明抑制miR-1260a的表达可抑制前列腺癌细胞增殖。研究表明，P21可负向调控细胞周期，并可诱导细胞周期停滞于G1期，Cyclin D1在多种肿瘤中表达增加，并可通过增加CDK活性从而促进细胞生长，P21可抑制Cyclin D1与CDK的活性[13]。本研究结果显示抑制miR-1260a的表达后DU145细胞中P21的表达水平显著升高，Cyclin D1的表达水平显著降低，提示抑制miR-1260a的表达可通过上调P21的表达及下调Cyclin D1蛋白的表达而抑制前列腺癌细胞的增殖。流式细胞术检测结果显示抑制miR-1260a的表达后前列腺癌细胞凋亡率显著升高。研究表明，抗凋亡基因Bcl-2与促凋亡基因Bax是调控细胞凋亡的重要基因[14]。本研究结果显示，抑制miR-1260a的表达后前列腺癌细胞中Bcl-2的表达水平显著降低，Bax的表达水平显著升高，提示抑制miR-1260a的表达可通过上调Bax的表达及下调Bcl-2的表达从而诱导前列腺癌细胞凋亡。研究表明，E-cadherin表达水平降低可减弱细胞间的黏附从而促进肿瘤细胞转移，MMP-2表达水平升高可降低细胞外基质从而促进肿瘤细胞的侵袭及转移[15]。本研究结果显示抑制miR-1260a的表达后DU145迁移及侵袭细胞数均显著减少，并可降低MMP-2的表达，促进E-cadherin的表达，提示抑制miR-1260a的表达可通过上调E-cadherin的表达及下调MMP-2的表达从而抑制前列腺癌细胞迁移及侵袭。

FEZ1在食管癌、口腔鳞癌等肿瘤中均呈低表达并可发挥抑癌基因作用，研究表明，FEZ1的表达降低可促进恶性肿瘤的发生发展[16]。研究表明，FEZ1在宫颈癌中呈低表达，其低编导量与患者总生存期、淋巴结转移等密切相关[17,18]。本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实FEZ1是miR-1260a的靶基因，miR-1260a可负性调控靶基因FEZ1的表达，进一步研究发现抑制FEZ1的表达可逆转抑制miR-1260a的表达对前列腺癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。提示抑制miR-1260a的表达可通过上调FEZ1的表达，从而达到抑制前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的目的，诱导细胞凋亡。

综上所述，miR-1260a在前列腺癌中呈高表达，并可能通过抑制FEZ1的表达促进前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭，抑制细胞凋亡，为揭示前列腺癌进展及转移的分子生物学机制提供新方向，可为前列腺癌的分子靶向治疗提供实验依据。但仍需从动物模型与临床研究分析miR-1260a与FEZ1对前列腺癌严重程度、治疗效果及患者预后的预判价值。