毛蕊异黄酮调控TLR4/p38MAPK通路减轻脓毒症大鼠心肌损伤的机制研究

刘杰 李萍 高彦霞 吴瑶

脓毒症是常见的、严重的全身炎性反应综合征，也是临床上常见的死亡病因。据报道，我国脓毒症的发病率高，且近年来一直保持着居高不下的态势[1]。有资料显示，脓毒症可发展为多脏器功能衰竭，病死率高达30%～50%，是严重困扰医务工作者的重大疾病之一[2]。目前临床针对脓毒症患者常用的治疗手段包括控制感染、早期液体复苏、清除内毒素等，可控制病情，降低病死率，但仍有部分患者病情进展。心肌损伤是脓毒症常见的继发症，可削弱心功能甚至诱发心力衰竭[3]。Toll样受体4(TLR4)/丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路是炎性反应性疾病经典的信号传导途径，在炎症环境中该通路被激活，TLR4高表达，增加磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)水平，诱发组织损伤，已被证实与脓毒症心肌损伤有关[4-6]。毛蕊异黄酮是一种常用的化学药品原料，具有抗氧化、保护心脑血管、舒张血管平滑肌等作用，有研究报道该药物可减轻心肌损伤[7]。故此推测毛蕊异黄酮可能通过调控TLR4/p38MAPK通路减轻脓毒症心肌损伤，但仍缺乏有力证据，需深入探讨验证。鉴于此本研究特设计大鼠对照试验，并将不同浓度毛蕊异黄酮的作用与乌司他丁做对比，明确该药物对脓毒症大鼠心肌损伤的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：54只成年SD大鼠，7～9周龄，无特定病原体级，雌27只雄27只，180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物合格证号：SCXK(京)2018-0001。

1.1.2 试剂：毛蕊异黄酮(上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%)；乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司)；0.9%氯化钠溶液(北京高科恒辉技术发展有限公司)；鼠TLR4、TNF-α、NO酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(武汉赛培生物科技有限公司)；苏木素-伊红染色(HE)试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)试剂盒(美国Roche公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；TLR4、p38MAPK及内参β-actin上下游引物合成(上海生工科技有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)；兔抗鼠TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK单克隆抗体(一抗)(美国Acadm公司)；山羊抗兔TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK多克隆抗体(以酶标记，二抗)(美国Acadm公司)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(上海化科实验器材有限公司)。

1.1.3 仪器：超净工作台(美国Labconco公司)；14型台式离心机(德国Sigma公司)；RM2235型切片机(德国Leica公司)；DSX1000型光学显微镜(日本Olympus公司)；7500型聚合酶链反应(PCI)扩增仪及配套分析软件(美国ABI公司)；Trans-BlotTurbo型转膜仪(美国Bio-Rad公司)；GelDocEZ型凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组、建模：54只成年SD大鼠随机分为6组，包括正常对照组(NC)、模型对照组(MC)、阳性对照组(PC)、毛蕊异黄酮低浓度组(A)、毛蕊异黄酮中浓度组(B)、毛蕊异黄酮高浓度组(C)，每组9只。除正常对照组(NC)外其余均建立脓毒症模型，建模方法：参照文献[8]，方法为盲肠结扎穿孔术，具体操作：戊巴比妥腹腔注射麻醉，腹正中位置做长约1.5 cm切口，寻找盲肠，结扎其根部。以18G针穿通2次，将肠内容物挤出少量。留置2 cm皮瓣，还纳盲肠，对腹壁切口逐层缝合，术后常规抗感染、抗休克。NC组操作大致同上，但无需实施环形结扎和穿孔操作。

1.2.2 药物：PC组予以乌司他丁100 kU/kg溶于1 ml/100 g 0.9%氯化钠溶液中经腹腔注射；干预 A、B和C组分别予以5、10、20 mg/kg毛蕊异黄酮溶于1 ml/100 g 0.9%氯化钠溶液中经腹腔注射；MC和NC组均予以1 ml/100 g 0.9%氯化钠溶液经腹腔注射。1次/d，干预1周。

1.2.3 心肌组织TLR4、TNF-α、NO含量检测:采用ELISA检测。麻醉下处死大鼠，迅速剥离心脏组织，取约40 mg心尖周围组织匀浆，按照3 500 r/min转速离心10 min，离心半径为8 cm。取上清并严格按照ELISA试剂盒检测心肌组织TLR4、TNF-α、NO含量。

1.2.4 心肌组织病理改变观察和细胞凋亡检测:采用HE法观察心肌组织病理改变，具体操作：同上述方法取心肌组织，固定、包埋、切片、脱蜡和水化，严格按照HE试剂盒染色，封片。在400倍光镜下观察心肌纤维和心肌细胞变化。采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数(AI)，具体操作：严格按照TUNLE试剂盒操作，阳性染色为凋亡细胞。光镜下随机选取10个不重复视野统计阳性细胞占比，计算均值即为AI。

1.2.5 心肌组织TLR4、p38MAPK mRNA表达检测:采用实时PCR(RT-PCR)检测，具体操作：同上述方法取心肌组织，液氮冷冻，匀浆后加入Trizol试剂1 ml，反复研磨。按照14 000 r/min转速离心10 min，离心半径为3 cm。以酚-氯仿抽提核糖核酸(RNA)，逆转录。按照说明书配置反应体系，其中TLR4 上游引物：5’-ACTGCTCTGATATGATCGATAGCTAT-3’；下游引物：5’-TCGATAGCTAGATCGATTAGCTATGATCTAG-3’，长度18 bp、20 bp；p38MAPK 上游引物：5’-TACGCTAGATTTAGCTATAGCTAGGCGAACTC-3’；下游引物：5’-ATCGCTAGATCGATATATCGATCGTAGCT

AGCTA-3’，长度20 bp、20 bp；β-actin为内参，上游引物：5’-CTGCTAGATGCTTATAGCTATTAGCTATAGCTA

GATCGACTAGT-3’；下游引物：5’ATGCCTGAATTCGA

TAGCTATAGCTAGATCGACCG-3’，长度20 bp、20 bp。按照如下流程进行扩增反应，95℃(30 s预变性)，35个循环：95℃(5 s变性)、58℃(20 s延伸)，最后60℃(5 min持续延伸)。采用配套分析软件确定目的基因的相对表达量，即2-ΔΔCt。

1.2.6 心肌组织TLR4、p38MAPK蛋白表达和p-p38MAPK水平检测:采用蛋白质免疫印迹法(WB)检测，具体操作：同上述方法取心肌组织，液氮冷冻，匀浆。按照14 000 r/min转速离心10 min，离心半径为3 cm。取上清液分离总蛋白，采用BCA试剂盒定量，转移至PVDF膜。封闭后加入一抗，孵育过夜(4℃)；加入二抗，孵育2 h(25℃)。显色并采用凝胶成像分析系统扫描，分析结果，计算蛋白相对表达量和p-p38MAPK水平，其中前者为目的蛋白的灰度值与内参β-actin灰度值的比值，后者为p-p38MAPK的灰度值与p38MAPK灰度值的比值。

2 结果

2.1 干预后心肌组织TLR4、TNF-α、NO含量比较 MC、PC、A、B、C组实验期间分别有1只、1只、1只、1只、0只建模失败，建模成功率为91.11%(41/45)，无大鼠意外死亡。干预后MC组心肌组织TLR4、TNF-α、NO含量均高于NC组(P<0.01)，且PC组、A组、B组、C组均低于MC组(P<0.01)，PC组、B组和C组均低于A组(P<0.01)，C组均低于PC组和B组(P<0.01)。见表1。

表1 干预后心肌组织TLR4、TNF-α、NO含量比较

2.2 6组大鼠心肌组织病理变化 NC组大鼠心肌组织细胞均匀分布、纤维条理清晰、呈长梭形；MC组心肌细胞肿胀变形、甚至破裂，大量细胞核固缩深染，心肌纤维严重紊乱、变形；A组心肌细胞肿胀变形，部分细胞核固缩深染，心肌纤维有明显紊乱、变形；PC组和B组部分心肌细胞肿胀变形，少量细胞核固缩深染，心肌纤维有紊乱、轻微变形；C组少量心肌细胞肿胀变形，较少细胞核固缩深染，心肌纤维有紊乱表现，大多呈长梭形且结构致密。见图1。

2.3 干预后心肌细胞凋亡指数对比 干预后MC组心肌细胞AI高于NC组(P<0.01)，PC组、A组、B组、C组均低于MC组(P<0.01)，PC组、B组和C组均低于A组(P<0.01)，C组均低于PC组和B组(P<0.01)。见图2，表2。

2.4 干预后心肌组织TLR4、p38MAPK mRNA表达对比 干预后MC组心肌组织TLR4 mRNA表达均高于NC组(P<0.01)，PC组、A组、B组、C组均低于MC组(P<0.01)，PC组、B组和C组均低于A组(P<0.01)，C组均低于PC组和B组(P<0.01)。6组p38MAPK mRNA表达对比差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.5 干预后心肌组织TLR4、p38MAPK蛋白表达及p-p38MAPK水平对比 干预后MC组心肌组织TLR4 蛋白表达、p-p38MAPK水平均高于NC组(P<0.01)，PC组、A组、B组、C组均低于MC组(P<0.01)，PC组、B组和C组均低于A组(P<0.01)，C组均低于PC组和B组(P<0.01)。各组p38MAPK 蛋白表达对比差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4，图3。

图1 6组大鼠心肌组织纵切面病理变化(HE×400)

图2 6组心肌细胞AI检测(TUNEL×100)

表2 干预后心肌细胞凋亡率比较

表3 干预后心肌组织TLR4、p38MAPK mRNA表达比较

3 讨论

脓毒症早期多以炎性介质增加为基本改变，机体可释放大量的促炎性因子，包括TNF-α、白介素-6、TLR4等，而抗炎性因子如蛋白激酶C、白介素-4等则分泌较少，难以有效对抗炎性介质的作用，二者平衡被打破，导致过度炎性反应[9]。研究指出，在脓毒症发生后，促炎性因子的大量释放可损伤血管内皮细胞，进而造成心脏、肾脏等多个重要脏器功能损害[10]。TNF-α的大量合成和分泌可诱导NO表达上调，并通过NO依赖途径介导心肌组织损伤[11]。因此在对脓毒症实施抗心肌损伤治疗时应积极抗炎，纠正促炎性因子和抗炎性因子的平衡。

表4 干预后心肌组织TLR4、p38MAPK蛋白表达及p-p38MAPK水平比较

图3 干预后6组心肌组织TLR4、p38MAPK蛋白表达及p-p38MAPK水平检测(WB)

心肌组织中促炎因子含量是反映炎性反应程度的直接指标，同时也是评价炎性反应损伤情况的重要标志。本次研究中，干预后MC组心肌组织TLR4、TNF-α、NO含量均远高于NC组，PC组和3浓度组均较MC组下降，提示乌司他丁和毛蕊异黄酮均可减轻脓毒症大鼠心肌组织炎性损伤程度，且其作用呈浓度依赖性。在病理学观察结果中可见MC组心肌组织纤维、细胞均严重改变，PC组和3浓度组均有所减轻，且C组与NC组病理学表现最为接近，提示乌司他丁和毛蕊异黄酮均可减轻脓毒症大鼠的心肌组织病变，且高剂量毛蕊异黄酮的作用更佳。毛蕊异黄酮是黄芪的有效成分之一，黄芪具有益气复脉、活血化瘀、解毒祛瘀的功效，毛蕊异黄酮也被证实可促使心肌供血恢复，减轻缺血诱导的炎性损伤[12]。有研究发现，毛蕊异黄酮可清除氧自由基、抗氧化应激损伤，还可调节促炎性因子和抗炎性因子的平衡，控制炎性反应对心肌组织造成的损伤[13]。本研究还发现MC组心肌细胞AI显著高于NC组，PC组和3浓度组心肌细胞AI则较MC组显著降低，且C组明显低于其余3组，提示毛蕊异黄酮可控制脓毒症大鼠心肌细胞凋亡，且高浓度的作用效果更佳。

TLRs是炎性信号转导的门户蛋白，TLR4激活可持续诱导炎性反应，并协同p38MAPK参与脓毒症心肌损伤的病变过程。本研究TLR4、p38MAPK mRNA与蛋白，p-p38MAPK水平对比结果中显示，MC组TLR4 mRNA与蛋白，p-p38MAPK水平相较于NC组均显著升高，PC组和3浓度组相较于MC组显著下降，且C组明显低于其余3组，推测毛蕊异黄酮可能对脓毒症大鼠心肌组织TLR4/p38MAPK信号通路有调控作用。在一项脓毒症并心肌损伤发生机制的实验研究中表明，TLR4能对病原相关分子模式特异性识别，刺激信号转导，并且可介导促炎性介质的合成和释放，诱发和加重心肌组织炎性损伤[14]。而p38MAPK是其下游重要的炎性反应调控指标，TLR4被激活后可促进p38MAPK的磷酸化反应。p-p38MAPK则可促进白细胞的聚集、活化，调节转录因子的活性，促进细胞因子的合成，并且还可调控炎性反应，通过一系列级联反应，最终可参与脓毒症介导的心肌损伤。国内外也有相关报道证实TLR4/p38MAPK信号通路的活化在脓毒症肺损伤、心肌损伤、肾损伤等疾病发生中均积极参与[15-17]，与此同时TNF-α、NO水平增高，从而参与组织炎性反应损伤，表明在脓毒症治疗中抑制TLR4/p38MAPK信号通路相关因子，下调TLR4基因与蛋白表达，控制p-p38MAPK水平对减轻多种脏器结构组织损伤具有重要的意义。有研究显示，毛蕊异黄酮可通过抗心肌细胞缺氧诱导的氧化应激和炎性反应从而减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤[18]。另有报道指出，对老年脓毒症大鼠予以参附注射液治疗可减轻心肌损害，发挥心肌保护作用，且证实与抑制TLR4的活性、控制炎性因子水平有关[19]。

综上所述，对脓毒症大鼠予以毛蕊异黄酮可减轻心肌组织炎性和病理损伤，减少心肌细胞凋亡，且在一定范围内用药浓度越高毛蕊异黄酮的作用越佳，推测与抑制TLR4的活性，降低p-p38MAPK水平有关，为临床用药的研究提供了新的方向。