VEGFR1下调对Aβ1-42诱导人脑微血管内皮细胞衰老及PI3K信号通路的影响

刘洁

阿尔茨海默病是一种起病隐匿的进行性发展的神经退行性疾病，主要发生于>85岁的老人[1]，对老年人的晚年身体健康及精神健康造成严重伤害，给社会和家庭带来了极大负担。研究表明阿尔茨海默病发病与Aβ1-42 (amyloid β1-42，Aβ1-42)在脑血管内皮沉积，导致脑血管内皮细胞的衰老死亡有关[2]。血管衰老会改变血管的形态和功能，如：血管内膜增厚以及内皮功能失调等[3]。血管内皮细胞是血管内皮的主要成分，对血管的生成、收缩等具有重要调节作用，可一定程度维持血管系统稳定[4]。血管内皮生长因子(vascular endothelial grow the factor,VEGF)是机体内最重要的血管生成因子[5]，可与血管内皮生长因子受体1(vascular endothelial growth factor receptor1，VEGFR1)结合促进新生血管生成。研究表明PI3K/Akt/mTOR信号轴中效应分子p-Akt、p-mTOR等蛋白在婴幼儿增生期血管瘤组织中的表达水平明显高于消退期，对血管生成具有重要作用[6]。本研究通过沉默VEGFR1基因在HBMEC细胞中表达并用Aβ1-42诱导细胞衰老，检测4组细胞的衰老及VEGFR1、PI3K/Akt通路相关蛋白表达情况，探讨VEGFR1在人脑微血管内皮细胞衰老中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人脑微血管内皮细胞HBMEC，产品编号为CL0116，购自丰晖生物有限公司；pGPU6/GFP/Neo质粒，货号：pGPU6/GFP/Neo，购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。

1.2 仪器与试剂 Aβ1-42多肽，货号：04010011827，规格：5 mg，95%，购自苏州强耀生物科技有限公司；人胆囊收缩素/缩胆囊素八肽(Cell Counting Kit-8，CCK-8)ELISA Kit，货号：69-80160，购自武汉默沙克生物科技有限公司； β-半乳糖苷酶染色试剂盒，货号：G1580-100T，购自北京索莱宝有限公司；LipofectaminTM 2000，货号为：rs374987523，购自美国Invitrogen公司；鼠抗人VEGFR1、p-Akt、p-mTOR、PI3K单克隆抗体购自于美国Sigma公司，货号分别为：RAB1088、RAB1435、RAB1517、RAB1532；PVDF膜购于上海生工生物工程有限公司，货号：F619537；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗购自于上海生工生物工程有限公司，货号：D110098；蛋白提取试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒购自美国Thermo公司，货号分别为：C510003、C503021；蛋白凝胶成像仪，购自Bio-Red公司，型号：Gel Doc XR+；Attune NxT 流式细胞仪，型号：Attune NxT，购自ThermoFisher公司。

1.3 方法

1.3.1 靶向VEGFR1寡核苷酸的设计与合成:参考siRNA设计原则[2,5]，设计了3条针对VEGFR1的siRNA(VEGFR1 siRNA-1、-2、-3)，另设计1条无关序列作为阴性对照。对于每条选定的siRNA序列，设计2条编码该序列的单链寡核苷酸(single-strand oIigonucleotide，SS oligo)模板，交西安擎科生物科技有限公司合成。

1.3.2 siRNA表达载体的构建:将合成的SS oligo退火，与经过用BamH Ⅰ与Bgl Ⅱ双酶切的质粒pGPU6/GFP/Neo连接，热转化至大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，用质粒提取试剂盒抽提质粒，操作步骤严格按照说明书进行。

1.3.3 细胞培养及分组:细胞于37℃、5%CO2、饱和湿度下，用10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养。收集对数生长期HBMEC细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，接种于6孔细胞板(1×106个/孔)，待细胞融合度至80%时，更换为无血清DMEM培养基，采用LipofectamineTM3000法进行转染，严格按照试剂盒说明书进行操作，转染后用无血清DMEM培养基继续培养24 h，更换为含终浓度为50 μmol/LAβ1-42的培养基对细胞进行处理。实验分为4组：(1)HBMEC组：不做转染，不用Aβ1-42处理；(2)HBMEC+ Aβ1-42组：不做转染，用Aβ1-42处理；(3)neg+Aβ1-42组：转染携带有VEGFR1siRNA-neg质粒，用Aβ1-42处理；(4)VEGFR1 siRNA+Aβ1-42组：转染携带有VEGFR1siRNA质粒，用Aβ1-42处理，以VEGFR1 siRNA-3干扰效果最优，进行后续实验。Aβ1-42诱导48 h后，收集4组细胞，进行后续实验。每组设置3个重复。

1.3.4 CCK-8法检测细胞活力:将1.3.3中的HBMEC+ Aβ1-42组、neg+Aβ1-42组、VEGFR1siRNA+Aβ1-42组细胞均加入50 μmol/L Aβ1-42，HBMEC组加入等量的PBS溶液，培养24 h后加入CCK-8 10 μl 继续培养1 h。每组设3个复孔，酶标仪450 nm波长处测定光密度(OD)，以OD值的大小评价细胞活力。

1.3.5 Hochest 33342/PI双染法检测细胞凋亡情况:收集1.3.3中4组细胞，用Hochest 33342/PI双染检测各组HBMEC细胞凋亡情况，蓝色为正常细胞，亮蓝色为凋亡细胞，红色为死亡细胞。

1.3.6 β-半乳糖苷酶染色试剂盒(β-Galactosidase Staining Kit)检测细胞衰老情况:收集1.3.3中4组细胞，采用β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测各组HBMEC细胞衰老情况，衰老细胞呈蓝色，具体操作步骤严格按照说明书进行。

1.3.7 蛋白印迹(western blot，WB)法检测细胞VEGFR1、p-Akt、p-mTOR、PI3K蛋白的表达:按照蛋白提取试剂盒说明书进行提取1.3.3中4组细胞中的总蛋白，采用BCA蛋白试剂盒对细胞中总蛋白含量进行测定。采用SDS-PAGE分离等量蛋白质，将蛋白质转PVDF膜上，置于4℃下添加VEGFR1、p-Akt、p-mTOR、PI3K一抗及β-actin一抗抗体(1：500)，孵育过夜。洗涤后添加辣根过氧化物酶缀合的二抗(1∶5 000)常温下孵育2 h。采用Tanon 600图像分析系统对蛋白水平VEGFR1、p-Akt、p-mTOR、PI3K进行定量分析。

2 结果

2.1 沉默VEGFR1对4组HBMEC细胞活力的影响 与HBMEC组比较，HBMEC+Aβ1-42组、neg+Aβ1-42组、VEGFR1 siRNA+Aβ1-42组细胞活力显著下降(P<0.05)；与HBMEC+Aβ1-42组、neg+Aβ1-42组相比，VEGFR1 siRNA+Aβ1-42组细胞活力显著降低(P<0.05)，HBMEC+Aβ1-42组与neg+Aβ1-42组细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 沉默VEGFR1对各组HBMEC细胞活力的影响

2.2 沉默VEGFR1对Aβ1-42诱导的HBMEC细胞凋亡的影响 Hochest双染结果显示，HBMEC组细胞呈圆形，细胞核呈淡蓝色，几乎无凋亡细胞；HBMEC+Aβ1-42组、neg+Aβ1-42组HBMEC细胞细胞核多呈亮蓝色，凋亡细胞较多，红色细胞核几乎不可见；VEGFR1 siRNA+Aβ1-42组多数细胞细胞核呈亮蓝色或红色，凋亡、死亡细胞进一步增多。见图1。

图1 沉默VEGFR1对各组HBMEC细胞衰老的影响

2.3 沉默VEGFR1对4组HBMEC细胞衰老的影响 与HBMEC组比较，HBMEC+Aβ1-42组、neg+Aβ1-42组、VEGFR1 siRNA+Aβ1-42组均衰老细胞比例明显升高(P<0.05)；与HBMEC+Aβ1-42组、neg+Aβ1-42组比较，VEGFR1 siRNA+Aβ1-42组细胞衰老比例明显增高(P<0.05)；HBMEC+Aβ1-42组、neg+Aβ1-42组衰老细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 沉默VEGFR1对各组HBMEC细胞衰老的影响

2.4 沉默VEGFR1对各组HBMEC细胞VEGFR1、p-Akt、p-mTOR、PI3K蛋白的影响 与HBMEC组相比，HBMEC+Aβ1-42组、neg+Aβ1-42组、VEGFR1 siRNA+Aβ1-42组细胞p-Akt、p-mTOR、PI3K蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)，VEGFR1蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)；与HBMEC+Aβ1-42组、neg+Aβ1-42组相比，VEGFR1 siRNA+Aβ1-42组细胞p-Akt、p-mTOR、PI3K蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)，VEGFR1蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)；HBMEC+Aβ1-42组、neg+Aβ1-42组细胞VEGFR1、p-Akt、p-mTOR、PI3K蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3，图2。

3 讨论

阿尔茨海默病是一种严重危害老年人的慢性中枢神经系统变性病，该病的主要病理学变化是β淀粉样蛋白(Aβ)斑块和神经原纤维缠结[7]。研究表明Aβ1-42可作为阿尔茨海默病模型大鼠的诱导剂[8]，Aβ1-42还能够诱导大鼠衰老，并对大鼠的脑突触小体造成一定程度的毒性伤害，对加快大鼠脑组织的老化亦具有一定作用[9]。但是Aβ1-42如何对该疾病产生作用目前仍不清楚[10]。本研究结果显示，HBMEC组细胞呈圆形，细胞核呈淡蓝色，几乎无凋亡细胞；Aβ1-42处理后，细胞核多呈亮蓝色，凋亡细胞较多，红色细胞核几乎不可见，细胞存活率下降，衰老凋亡细胞增多，提示Aβ1-42可成功诱导HBMEC细胞衰老，促进细胞凋亡。进一步研究发现，用 VEGFR1 siRNA干扰后，与HBMEC+Aβ1-42组、neg+Aβ1-42组比较，VEGFR1 siRNA+Aβ1-42组细胞存活率显著降低，衰老凋亡细胞增多，提示沉默VEGFR1基因可进一步促进HBMEC细胞衰老及凋亡。

表3 沉默VEGFR1对4组HBMEC细胞VEGFR1、p-Akt、p-mTOR及PI3K蛋白的影响

图2 WB检测4组HBMEC细胞VEGFR1、p-Akt、p-mTOR、PI3K蛋表达;1 HBMEC组；2 HBMEC+Aβ1-42组；3 neg+Aβ1-42组；4 VEGFR1 siRNA+Aβ1-42组

VEGF属于血小板衍生生长因子家族的一员，于1989年首次在体外被分离，可与其特异性受体VEGFR结合后，参与调节新生血管增生、诱导血管形成[11-13]。目前已知的VEGFR主要有五种，分别是VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、NRP-1和NRP-2[14]。血管内皮细胞中主要包括VEGFR1和VEGFR2，其中VEGFR1既能够促进微血管内皮细胞增殖，又能刺激体内新生血管生成，参与多种病理生理过程[15,16]。本研究发现，与HBMEC组比较，HBMEC+Aβ1-42组、neg+Aβ1-42组细胞中VEGFR1表达显著降低，提示Aβ1-42诱导可下调HBMEC细胞中VEGFR1表达，可能与细胞衰老有关。本研究进一步采用VEGFR1 siRNA处理HBMEC细胞，结果发现，与HBMEC+Aβ1-42组、neg+Aβ1-42组比较，VEGFR1 siRNA+Aβ1-42组HBMEC细胞中VEGFR1表达显著降低，提示成功沉默VEGFR1基因表达。

PI3K/Akt是细胞内一种重要的信号转导通路，包括磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threoninekinase，AKT)等多种蛋白，参与调节细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等多种生物学功能[17]。研究报道PI3K/Akt信号通路与血管生成密切相关，陈德才[18]等证明PI3K/AKT信号通路参与血管瘤细胞的增殖、凋亡过程。PI3K/Akt信号通路调节单核细胞/巨噬细胞中VEGFR1表达[19]，对多种血管生成因子具有调节作用，能够上调VEGF表达，调节血管生成[20]。本研究结果显示，与HBMEC组比较，HBMEC+Aβ1-42组、neg+Aβ1-42组细胞中细胞中p-Akt、p-mTOR及PI3K蛋白表达水平降低，提示Aβ1-42可抑制人脑微血管内皮细胞中PI3K/Akt信号通路活化。进一步分析发现，与HBMEC+Aβ1-42组、neg+Aβ1-42组比较，VEGFR1 siRNA+Aβ1-42组细胞中p-Akt、p-mTOR及PI3K蛋白表达水平显著降低，提示沉默VEGFR1可进一步抑制人脑微血管内皮细胞中PI3K/Akt信号通路激活，可能与促进Aβ1-42诱导的HBMEC细胞衰老有关。

综上所述，沉默VEGFR1表达可能通过抑制PI3K/Akt信号通路，促进Aβ1-42诱导的HBMEC细胞衰老、凋亡程度，提示VEGFR1可能在阿尔茨海默病发生发展中具有重要作用，但是其具体作用机制尚需进一步研究。