超声辅助提取大豆糖蜜沉淀中异黄酮和皂苷的工艺研究

□ 张倩瑶 梁世君 桐庐县检验检测中心

大豆糖蜜的主要成分是糖，含量在58%～65%，包括低聚糖、二糖和少量单糖。次要成分包括蛋白质、脂质、矿物质、大豆皂苷（6%～15%）、大豆异黄酮（0.8%～2.5%）和其他有机成分，包括酚酸，无色花青素等[1]。

异黄酮仅存在于豆科的蝶形花亚科[2]等少数植物中。目前鉴于异黄酮具有雌激素类性质，因对人体健康有益而被广泛关注[3]。大豆糖蜜作为异黄酮的丰富来源，关于其的提取与富集研究文献主要是一些专利，国内相关的研究报道还不是很多[4]。

大豆皂苷毒副作用很小，并且具有很多有益的生理功能[5]。随着大豆皂苷在食品领域应用的增加和其众多的有益生理功效，其商业价值正逐渐得到人们的重视，这也就促进了对大豆皂苷产品生产提取工艺的研究。

超声辅助提取技术的原理是超声波传播过程中产生的强烈空化、扰动效应，可增大提取溶剂中物质分子运动频率和速度，增强溶剂穿透力，从而加速提取溶剂中的目标成分进入溶剂，促进提取的进行。目前，超声辅助提取技术被广泛应用于油脂提取、食品添加剂、食品原料中活性成分[6]和糖类物质等的提取分离。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大豆异黄酮标准品（纯度99.9%，购于sigma 公司），大豆糖蜜由山东万德福实业集团有限公司提供，Waters 600 高效液相色谱仪（美，Waters 公司），台式离心机TPL—5（上海安亭科学仪器厂），KJ—300 超声波发生器（无锡市科洁超声电子设备有限公司），旋转蒸发器 RE—52（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 实验方法

大豆糖蜜（粘稠液体状）经过稀释、酸沉、离心后得到大豆糖蜜沉淀，沉淀经冷冻干燥后得到大豆糖蜜沉淀干粉，为实验原料。

大豆皂苷含量的测定：香草醛—高氯酸法[7]。

大豆异黄酮总量测定：外标法，HPLC法[8]，反向色谱柱，C18柱250 mm×4.6 mm×5 μm；流动相，A 相：三氟乙酸—乙腈溶液，三氟乙酸体积分数为0.5%；B 相：三氟乙酸水溶液（三氟乙酸体积分数0.05%）；检测器类型：紫外检测器；测定波长，254 nm；色谱柱温度，34 ℃；洗脱方式：梯度洗脱；流速，1 mL/min；进样量，20 μL。

脂类测定：氯仿甲醇法[9]。

总糖含量测定：苯酚—硫酸法[10]。

1.2.1 超声辅助提取异黄酮

准确称取一定量的经冷冻真空干燥后的大豆糖蜜沉淀粉末，按照一定的料液比加入90%丙酮—水溶液，在设定温度下经超声提取一段时间后，过滤，滤渣再用相同体积分数溶液在普通磁力搅拌下提取1 h，合并滤液，旋转蒸发除去丙酮，测定其异黄酮总量，3 次重复。分别考察超声功率(超声频率为20 kHz)、料液比、提取时间对提取效果的影响，得到最佳的超声辅助提取条件。

1.2.2 回流提取皂苷

提取异黄酮后的滤渣，改变丙酮和水比例，调节pH 值，在一定温度下，加热回流提取皂苷，滤液旋转蒸发除去丙酮，测皂苷含量。

1.2.3 提取率和纯度的计算

提取率和纯度按照公式（1）和(2)计算。

2 结果与讨论

2.1 大豆糖蜜沉淀成分分析

由表1 可以看出，大豆糖蜜经酸沉后，异黄酮和皂苷的含量（一般糖蜜中异黄酮含量为0.8%～2.5%，皂苷含量为6%～15%）有所上升。这主要是由于大豆糖蜜中含有大量的碳水化合物，主要是一些水溶性的糖类，而低聚糖和单糖、双糖等是不带电荷的，所以在酸性条件下不会沉淀下来。皂苷和异黄酮以及大部分磷脂、植酸、酚酸等分子带负电荷，在酸性条件下因形成聚集体而沉淀下来，从而实现了初步富集。酸沉沉淀中，异黄酮和皂苷含量高，适合作为提取异黄酮和皂苷的原料。

表1 大豆糖蜜沉淀成分分析

2.2 超声功率对异黄酮提取率的影响

准确称取糖蜜沉淀干粉6 份，每份10 g，按照料液比1 ∶10 加入一定体积分数的丙酮水溶液，室温条件下，在频率20 kHz，不同功率条件下超声30 min，除去丙酮，测定提取液中的异黄酮总量。比较超声功率对异黄酮提取率的影响，结果见图1。

图1 超声功率对异黄酮提取率的影响

由图1 可以看出，当超声功率在150 W 时，异黄酮的提取率达到最大，过高和过低都会降低异黄酮的提取率。这可能是由于超声功率越低，超声产生的机械作用越弱，而功率过高时，产生的空化效应弱，有效成分的溶出不充分，在空化作用的最佳结合点上，有效成分溶出最完全，总异黄酮提取率最大[11]。因而确定150 W 为适宜的提取功率。

2.3 超声时间对异黄酮提取率的影响

准确称取糖蜜沉淀干粉6 份，每份10 g，按照料液比1 ∶10 加入一定体积分数的丙酮水溶液，室温条件下，频率20 kHz，功率150 W 条件下超声不同时间，除去丙酮，测定提取液中异黄酮总量。比较超声时间对异黄酮提取率的影响，结果见图2。

图2 超声时间对异黄酮提取率的影响

由图2 可以看出，随着超声时间的增加，异黄酮提取率呈上升趋势，但在30 min 后，异黄酮提取率随着提取时间的增加而呈下降趋势。造成异黄酮提取率下降的原因可能是在长时间超声作用下，丙二酰基大豆苷的活性基团遭到破坏，降解为糖苷型异黄酮，糖苷型异黄酮的羟基也容易发生反应而被破坏，降低了总异黄酮含量，从而提取率呈降低趋势。这在不同时间提取液中异黄酮的HPLC 图谱中也可以看出。

国外文献中也有报道提出，在提取异黄酮时，长时间的超声会造成羟自由基发生反应，从而使目标产物发生降解[12]。因此30 min 是能达到较高异黄酮提取率的最佳时间。

2.4 料液比对异黄酮提取率的影响

准确称取糖蜜沉淀干粉5 份，每份10 g，按照不同料液比加入一定体积分数的丙酮水溶液，室温条件下，频率20 kHz，不同功率条件下超声30 min，滤液除去丙酮，测定提取液中异黄酮总量。比较超声功率对异黄酮提取率的影响，结果见图3。

图3 料液比对异黄酮提取率的影响

由图3 可以看出，随着料液比的增加，异黄酮提取率逐渐增加，但1 ∶20 与1 ∶30 的提取率相差不大，提取液用量大也会相应的增加成本，所以选用1 ∶20 的料液比作为超声提取的最佳料液比。

2.5 异黄酮和皂苷提取工艺条件的确定

丙酮是一种弱极性有机溶剂，对异黄酮有较高的溶解度[13]。而皂苷的分子量较大，极性大，易溶于极性较大的溶剂中。所以可以通过控制调节丙酮和水的比例以及调节不同的pH 值，分步提取异黄酮和皂苷，得到两者的粗品，为下一步的分离纯化提供方便。得出的具体工艺流程和工艺条件见图4。

图4 提取异黄酮和皂苷的工艺流程

2.6 最佳工艺条件下提取异黄酮和皂苷

在最佳工艺条件下分步提取得到异黄酮和皂苷粗品，分别旋转蒸发除去丙酮后冻干样品，测定粗品的质量以及异黄酮和皂苷的含量，并计算得到异黄酮粗品和皂苷粗品中异黄酮和皂苷的纯度以及提取率，如表2。

3 结论

本文研究了用丙酮水溶液作为提取溶剂，超声辅助提取，后加热回流提取异黄酮和皂苷，得到了较高提取率和纯度的异黄酮和皂苷粗品。

1.一定比例的丙酮水溶液作为异黄酮的良好溶剂，在超声辅助提取下，异黄酮的提取率达到85.96%，纯度为11.48%。

表2 异黄酮和皂苷的提取率与纯度

2.改变丙酮和水的比例，调节pH值，将滤渣进一步提取，可达到提取率为 76.91%，纯度为57.80%的皂苷粗品。

3.提取溶剂丙酮可回收再利用，对环境污染小，两次分步提取可得到异黄酮和皂苷粗品，工艺过程简单，提取率高，可进行大规模工业化生产。