基于高效液相色谱法结合层次分析和正交设计法优选土茯苓醇提工艺

黄诗淇，武正华，缪文清，周利娟，石文清，范国荣*（.广西中医药大学药学院，南宁 53000；.上海交通大学附属第一人民医院临床药学科，上海 00080）

土茯苓为百合科植物光叶菝葜（Smilax glabraRoxb）的干燥根茎。性平，味甘淡，归肝胃脾经，具有清热除湿、解毒、通利关节等功效[1-3]。据文献报道[4-5]，土茯苓不仅可以通过抑制肝脏中黄嘌呤氢化酶（XDH）mRNA 和黄嘌呤氧化酶（XOD）的活性来达到降尿酸的作用，还可以通过下调血清中尿酸和肌酐的水平，对高尿酸血症小鼠起到治疗作用。张白嘉等[6]发现土茯苓对二甲苯所致小鼠耳肿胀、蛋清及角叉菜胶所致小鼠足肿胀均有明显抑制作用；落新妇苷对尿酸钠所致大鼠痛风性关节炎有治疗作用，同时可明显增加大鼠的尿量；对醋酸所致小鼠扭体反应有明显的抑制作用；以及对热板法引起的小鼠足痛有对抗作用，证实了土茯苓及落新妇苷具有抗炎、镇痛、利尿等作用。

土茯苓含多种化学成分，包括糖、有机酸、苯丙素、黄酮及黄酮苷、甾醇、皂苷和挥发油等[3]。目前对土茯苓化学成分的研究主要集中在黄酮类物质。其中黄杞苷作为土茯苓中重要的活性成分；落新妇苷作为土茯苓的指标性成分，具有热不稳定性，提取过程中不可避免地会分解生成新落新妇苷、异落新妇苷和新异落新妇苷3 种同分异构体，上述5 种化学成分均属于二氢黄酮醇类物质。但是这5 种化学成分的含量在不同的提取工艺下又有显著的差异，因此，优化土茯苓中二氢黄酮醇类物质的提取工艺是十分有必要的。通过查阅土茯苓提取工艺的相关文献[7-14]，已报道的提取方法多是对土茯苓中单一的黄酮类物质的含量或者土茯苓总黄酮的含量进行评价来确定提取工艺，鲜有对土茯苓中二氢黄酮醇类化合物进行多指标的综合评价。中药提取工艺若仅以单一化学成分的含量高低或有效部位的含量高低来评价工艺的优劣，则会忽略多组分之间的协同或相互作用，因此，以多种化学成分的含量作为评价指标更有助于综合评价土茯苓的提取工艺[15]。

本试验通过选取提取时间、固液比、乙醇浓度为考察因素，以落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷、黄杞苷5 种二氢黄酮醇类成分的含量为评价指标。采用HPLC 法测定5 种指标成分的含量，通过正交试验设计优选出最佳的乙醇提取工艺，同时结合层次分析法（analytic hierarchy process，AHP）建立指标回归模型，确定各指标权重系数，以多指标综合评分法对提取方法进行综合全面的评价。以期为土茯苓的资源开发、工业化生产以及新药研发提供理论依据，为中药材提取工艺的研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo U-3000 超高效液相色谱仪、DAD 检测器（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；超声微波协同萃取/反应仪（CW-2000 型；上海新拓微波溶样测试技术有限公司）；SK7200H 超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；Sartorius CPA 225D 十万分之一电子天平（赛多利斯公司，德国）；粉碎机（上海淀久中药机械有限公司）；旋转蒸发仪（上海信科科技有限公司）。

1.2 试药

土茯苓（批号：191011-2，上海万仕诚国药制品有限公司）；落新妇苷对照品（批号：111798-201805，含量：93.6%）、黄杞苷对照品（批号：111906-201102，含量：93.7%）（中国食品药品检定研究院）；新落新妇苷对照品（批号：P08N9S74591）、新异落新妇苷对照品（批号：P30J11S117034）（含量≥ 98%，上海源叶生物科技有限公司）；异落新妇苷对照品（批号：190922-216，含量≥ 98%，江西江蓝纯生物试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，Merck），其他试剂均为分析纯，超纯化水（Milli-Q 系统）。

2 方法与结果

2.1 提取液的制备

土茯苓药材，粉碎，过60 目筛，备用。精密称取土茯苓粉末5 g，按以下3 种方法，分别进行提取试验，每种方法平行3 组。

2.1.1 加热回流提取法 参照《中国药典》[1]土茯苓提取方法并作适当修改：加60%乙醇100 mL 于样品中，浸泡8 h，60 ℃回流提取2 次，每次2 h，合并滤液，过滤，放置备用。

2.1.2 超声提取法 参照《中国药典》[1]与文献[12]的方法并改进：加60%乙醇 100 mL 于样品中，浸泡8 h，40℃超声（53 kHz，350 W）提取2 次，每次1 h，合并滤液，过滤，放置备用。

2.1.3 微波提取法 参照文献[10]的方法并改进：加60%乙醇100 mL 于样品中，浸泡8 h，80℃微波萃取，功率600 W，提取2 次，每次5 min，合并滤液，过滤，放置备用。

2.2 3 种提取方法的提取得率

按“2.1”项下不同提取方法制备土茯苓提取液，收集滤液，减压回收溶剂，干燥至恒定质量。计算不同提取方法所得提取物的得率，结果加热回流提取法、超声提取法、微波提取法的平均得率分别为24.51%、27.13%、15.19%，利用超声提取法制备提取物，能够更快更高效地将主要成分最大程度地提取出来。因此本试验选择超声提取法进行后续试验。

2.3 HPLC 法同时测定5 种指标成分

2.3.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷、黄杞苷对照品适量，加入甲醇溶解，摇匀，制成每1 mL 含落新妇苷1.0690 mg，新落新妇苷1.0470 mg，异落新妇苷0.8400 mg，新异落新妇苷1.0400 mg，黄杞苷0.8875 mg 的混合对照品储备液。

2.3.2 供试品溶液的制备 取“2.1.2”项下制得的提取液，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，放置冰箱4℃储存，备用。

2.3.3 色谱条件 色谱柱：Ultimate C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇（A）-0.1%乙酸水溶液（B），梯度洗脱（0 ～20 min，35%A；20 ～35 min，35% ～40%A；35 ～50 min，40%～45%A）；流速1.0 mL·min－1；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长291 nm。在此色谱条件下待测组分与其他组分分离效果良好，混合对照品溶液与3 种提取方法所得供试品溶液的HPLC 图见图1。

图1 混合对照品（A）、加热回流提取法样品（B）、超声提取法样品（C）和微波提取法样品（D）HPLC 色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of reference（A），heated reflux extraction（B），ultrasonic extraction（C），and microwave extraction（D）

2.3.4 线性关系 精密吸取“2.3.1”项下的混合对照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、2.5、4.0 mL，分别置于25 mL 量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，另取“2.3.2”项下混合对照品溶液，分别精密吸取10 μL，按“2.3.3”项下色谱条件进样测定。以对照品质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。5 种化合物在各自质量浓度范围内与峰面积线性关系良好。

表1 5 种指标成分的线性关系Tab 1 Linearity of 5 index components

2.3.5 精密度试验 精密吸取“2.3.1”项下混合对照品溶液，加50%甲醇稀释后，制得含落新妇苷85.56 μg·mL－1、新落新妇苷41.88 μg·mL－1、异落新妇苷33.60 μg·mL－1、新异落新妇苷41.60 μg·mL－1、黄杞苷35.50 μg·mL－1的混合对照品溶液。按“2.3.3”项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷和黄杞苷峰面积的RSD值分别为0.17%、0.36%、1.5%、1.8%、0.58%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验 精密称取同一批次土茯苓粉末，共6 份，每份5 g，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷和黄杞苷峰面积的RSD值分别为0.67%、1.4%、1.3%、2.2%、0.48%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验 取“2.3.2”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24、36、48 h，按“2.3.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果表明落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷和黄杞苷峰面积的RSD值分别为0.31%、0.42%、0.51%、1.6%、0.53%（n＝6），表明供试品溶液于室温下放置48 h 内稳定性良好。

2.3.8 加样回收试验 精密称取同一批土茯苓样品6 份，每份约2.5 g，加入一定量的对照品溶液，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液并测定峰面积，计算平均回收率及RSD值。结果表明，土茯苓中落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷及黄杞苷的平均回收率分别为94.7%、95.4%、93.2%、102.5%及99.2%，RSD值分别为2.2%、2.2%、1.8%、2.1%及2.0%，表明方法的准确度良好。

2.4 AHP 确定各指标权重系数

AHP 是一种将复杂问题中的各个因素，划分为相互联系的有序层次，再对各项影响因素的重要程度进行评分，确定其权重系数的分析方法。该方法将评价目标分为多个层次和若干指标，依照不同的权重进行综合的评价，利用权重求出各方案的优劣次序[16-18]。本试验结合正交设计试验将评价系统设计为三层，如图2。根据土茯苓活性成分所占比例，确定各指标的优先顺序为：落新妇苷＞异落新妇苷＞黄杞苷＞新落新妇苷＞新异落新妇苷，采用1 ～9 标度法对5 项指标进行两两比较评判重要性，按照几何平均法，计算各指标的权重系数[19-21]。各指标成分的评分标准见表2。5 种评价指标两两比较的判断优选矩阵见表3。

图2 土茯苓活性成分提取工艺优化层次结构模型Fig 2 Hierarchical structure of extraction optimization of bioactive components in Smilacis Glabrae Rhizoma

表2 5 种评价指标各层次评分标准Tab 2 Score standards for the 5 evaluation indexes

表3 指标层比较判断优选矩阵Tab 3 Judgment matrix

使用AHP 分析软件进行具体计算，求得落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷和黄杞苷各指标权重系数为0.6204、0.0776、0.1673、0.0379 和 0.0968。随机一致性比率CR＝CI/RI，当CR＜0.1 时，判断矩阵具有满意的一致性及权重计算正确性[21-24]。本次试验的一致性比率为CR＝0.0980 ＜0.1，表明权重计算正确、合理。

2.5 超声提取方法的单因素试验

2.5.1 提取时间对5 种评价指标总提取含量的影响 选取固液比为1∶20，乙醇浓度为60%，浸泡8 h，提取2 次，提取温度40℃，控制提取时间分别为15、30、60、90、120 min，每组平行3组，得到提取时间对5 种评价指标含量及总提取含量的影响，结果如图3所示。

图3 提取时间对5 种评价指标含量及总提取含量的影响Fig 3 Effect of extraction time on the contents of 5 evaluation indexes and total extraction contents

当提取时间在15 ～60 min 内，随着提取时间的增加，总提取含量不断增多；15 ～30 min 内，增加迅速；30 ～60 min 内总提取含量增长变缓，说明土茯苓药材内外浓度差逐渐达到平衡。60～120 min 内，随着提取时间增加，总提取含量略有下降。原因可能是，土茯苓药材粉末的内外浓度差达到提取平衡，增长提取时间无法再增加目标成分的总提取含量，长时间提取温度升高，破坏了土茯苓药材中一些活性成分，反而导致总提取含量减少。单因素结果表明，提取时间在30 ～60 min 内，提取效率较好。

2.5.2 固液比对5 种评价指标总提取含量的影响 选取提取时间为30 min，乙醇浓度为60%，浸泡8 h，提取2 次，提取温度40℃，控制固液比分 别 为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，每组平行3 组，得到固液比对5 种评价指标含量及总提取含量的影响，结果如图4所示。随着固液比的增加，指标成分的总提取含量呈下降趋势。可以推测出，当固液比为1∶10 时，所添加的液体体积与提取物之间的最佳比例达到峰值，后续增加液体体积无法再增加提取含量。因此本试验选择固液比为1∶10 进行后续试验。

图4 固液比对5 种评价指标含量及总提取含量的影响Fig 4 Effect of solid-liquid ratio on the contents of 5 evaluation indexes and total extraction contents

2.5.3 乙醇浓度对5 种评价指标总提取含量的影响 选取提取时间为30 min，固液比为1∶10，浸泡8 h，提取2 次，提取温度40℃，控制乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%，每组平行3 组，得到乙醇浓度对5 种评价指标含量及总提取含量的影响，结果如图5所示。当乙醇浓度在40%～60%，总提取物的含量随乙醇浓度的升高而增加，但增加不显著，说明乙醇浓度对土茯苓提取含量影响较小。乙醇浓度在60%～80%时，总提取含量呈下降趋势。

图5 乙醇浓度对5 种评价指标含量及总提取含量的影响Fig 5 Effect of ethanol concentration on the contents of 5 evaluation indexes and total extraction contents

2.6 正交试验设计

通过单因素试验结果，确定超声提取法对土茯苓有效成分进行提取，选择提取时间（A）、固液比（B）、乙醇浓度（C）为考察因素，设计L9（34）正交试验，因素水平见表4。

表4 正交试验因素水平表Tab 4 Factor and level of the orthogonal test

2.7 正交试验设计与结果

按正交设计表进行超声提取，分别测定各样品中落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷、黄杞苷的含量，结果见表5。

表5 超声提取正交试验结果Tab 5 Orthogonal test for extraction

2.8 提取工艺的确定

利用AHP 得到的权重系数对试验结果进行综合评分。极差分析结果见表5，方差分析结果见表6。由表5可知，各因素对土茯苓提取工艺作用主次为B ＞A ＞C，方差分析表明，B 因素对综合评分结果具有显著性影响（P＜0.05），A因素对结果影响不显著，从工业化生产的角度，考虑节约时间成本和经济成本、保护环境、生产安全等因素，故选择最佳提取工艺为A1B1C3。即土茯苓药材采用60%乙醇，浸泡8 h，固液比为1∶10，40 ℃超声提取2 次，每次提取30 min 进行提取。

表6 正交试验方差分析结果Tab 6 Analysis of variance

2.9 提取工艺验证试验

精密称取土茯苓药材3 份，按优选的最佳工艺A1B1C3条件进行提取，测定落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷和黄杞苷的含量，结果见表7。3 批验证试验综合评分均值为78.56，RSD值为0.34%，表明该提取方法工艺稳定可行，重复性较好，可用于土茯苓的提取制备。

表7 验证试验结果(n ＝3)Tab 7 Verification test (n ＝3)

3 讨论

3.1 提取方法及测定方法的选择

中药提取常用的方法有加热回流提取法、超声提取法、微波提取法、浸渍法、酶提取法等，本试验采用前3 种提取方法制备土茯苓提取物，通过比较提取物的得率，确定超声提取法能够更加快速高效地提取出土茯苓二氢黄酮醇类化合物。

目前对于土茯苓提取工艺的研究中多采用紫外分光光度法测定土茯苓中总黄酮的含量，而仅以土茯苓总黄酮的含量难以准确评价药材的整体质量。因此本文采用高效液相色谱法测定土茯苓中各质量标志性成分的含量，更加全面准确地评价药材的质量。

3.2 评价指标及指标权重的确定

落新妇苷和黄杞苷是土茯苓中重要的化学成分，也是土茯苓药材质量评价的标志性化合物，其中落新妇苷为热不稳定化合物，在较高温度下容易分解成其异构体，落新妇苷的异构体分别为新落新妇苷、异落新妇苷以及新异落新妇苷。因此，本试验选取落新妇苷及其3 个异构体，以及黄杞苷作为确定土茯苓醇提工艺的含量测定的评价指标。

指标权重系数的确定主要运用AHP，AHP在进行赋权时，通过数理运算将各指标的重要性转变为可量化的权重系数，这一过程虽然也存在一定的主观性，但比起单纯凭借经验赋值少了盲目性和随意性[24]，因此，AHP 应用于同一种药材中多种活性成分同时提取的工艺研究进行综合评价，其方法更为科学合理。

3.3 最佳工艺的筛选

通过对超声提取法进行单因素试验，根据单因素试验结果设计正交试验，并结合AHP 筛选出对于土茯苓中5 种二氢黄酮醇类化合物最佳的乙醇提取工艺，即土茯苓药材过60 目筛，采用60%乙醇，固液比为1∶10，浸泡8 h，40 ℃超声提取2 次，每次提取30 min。验证试验结果表明，基于AHP 确定的土茯苓中5 种二氢黄酮醇类成分含量的权重系数范围的综合评分作为优选最佳提取工艺的指标是科学合理的，且该优选工艺简单易操作、稳定可行，为中药有效成分的提取工艺筛选指标的确定提供了新思路。