白花蛇舌草内生真菌的分离与鉴定

赵作威，叶颖晓，刘明爽，文春南，王旭光，刘淼*，麻兵继，*（.河南农业大学 中药材系，郑州 450046；.河南白云牧港生物科技有限公司，河南 登封 45400）

白花蛇舌草（Hedyotis diffusaWilld.）是茜草科耳草属植物[1]，全草入药，具有清热解毒、利湿通淋等功效[2]。在我国安徽、云南以及两广地区均有分布[3]。白花蛇舌草在中医临床上常与其他药物配合使用以治疗各种癌症以及各种炎症，尤其在治疗恶性肿瘤方面是最常用的中药材之一[4-5]。因此，近年来，国内对白花蛇舌草的需求量剧增，导致野生资源逐渐减少[6]。为了满足市场需求，现多进行人工栽培。目前，白花蛇舌草在河南省确山县人工栽培规模较大，年产量约占全国总产量的一半，现已成为河南大宗药材之一[7]。

近年来，国内外学者对白花蛇舌草开展了大量研究，主要聚焦于栽培技术[8]、化学成分[9-10]、提取工艺[11]、质量标准[12-13]和药理作用[14-15]等方面。而对其内生真菌的研究尚未见文献报道。植物内生真菌是结构丰富多样、生物活性广泛的次生代谢产物的重要来源，在药物研发、植物病害防治等方面具有重要作用[16]。此外，有些药用植物内生真菌可产生与寄主植物相同或相似的活性物质，能够促进寄主植物次生代谢产物的形成和积累，提高活性成分的产量[17-19]。本研究对采自河南确山县的白花蛇舌草进行内生真菌的分离和鉴定，探究其内生真菌的种群结构，为进一步挖掘白花蛇舌草内生真菌及其活性次生代谢产物奠定基础。

1 材料

健康无病害的白花蛇舌草植株于2018年10月采自河南省确山县基地，经河南农业大学李贺敏副教授鉴定为Hedyotis diffusaWilld.。LDZF-50kB 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；SW-CJ-2D 型超净工作台（名牌之星）；QHZ-98A 全温震荡摇床（太仓市华美生化仪器厂）；GXZ 型（多段编程）智能光照培养箱（宁波江南仪器厂）；H1650-W 台式微量离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；PCR 仪（北京东胜创新生物科技有限公司）；电泳仪（JY300C通用型电源，JY-SPCT 型水平电泳槽，北京君意东方电泳设备有限公司）；2500R 型全自动数码凝胶图像分析系统（上海天能公司）；真菌通用引物ITS1 和ITS4（华大基因）；真菌基因组DNA 提取试剂盒、DNA Marker、Premix Taq、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar Medium，PDA）（北京索莱宝科技有限公司）。

2 方法

2.1 内生真菌的分离与纯化

剪取健康的白花蛇舌草植株，用无菌水将表面冲洗干净，放入超净工作台中紫外线消毒15 min，然后依次用75%乙醇（30 s）、3% NaClO 溶液（60 s）、75%乙醇（30 s）进行表面灭菌。用无菌水冲洗后，用已灭菌处理的手术刀将白花蛇舌草的根、茎和叶切成小块组织，接种到灭菌后的PDA 培养基上，每块PDA 培养基上，呈“品”字形放置三块植物组织，重复两组实验。然后将已接种的PDA平板置于恒温培养箱中在28℃的条件下培养。当培养基上观察到明显的菌丝时，用接种针将形态不同的真菌分别挑出，接种到新的PDA 培养基上进行菌种纯化，重复实验直至得到单一菌株。

2.2 内生真菌的鉴定

2.2.1 内生真菌基因组DNA 的提取 将分离纯化所得内生真菌，接种于PDA 培养基，置于恒温培养箱中28℃条件下培养5 d。取适量菌丝，参照真菌基因组DNA 提取试剂盒方法提取白花蛇舌草内生真菌的基因组。

加入20 μL 的RNase A 和100 mg 玻璃珠，用研磨仪研磨5 min。加入20 μL 蛋白酶K（10 mg·mL－1），混匀后置于55 ℃水浴锅中消化30 min，12 000 r·min－1离心3 ～4 min，吸取上清液，加入200 μL 溶液B 充分混匀。若出现白色沉淀，置于55℃水浴至溶液清亮。加入200 μL无水乙醇混匀，将溶液转移至吸附柱，放置2～5 min，12 000 r·min－1离心1 min。向吸附柱加入600 μL 稀释过的漂洗液，12 000 r·min－1离心2 ～3 min，弃去下层废液。然后将吸附柱放到收集管，离心2 min，取出吸附柱，低温烘干（45℃）或室温自然挥干吸附柱中的漂洗液。将吸附柱放入离心管中，滴加125 μL 洗脱液（65℃水浴保温），放置5 ～6 min，12 000 r·min－1离心1 ～2 min，将离心管中的洗脱液再次转移到吸附柱中，室温放置2 min，12 000 r·min－1离心2 min，即得内生真菌DNA。

2.2.2 内生真菌ITS 区的PCR 扩增与内生真菌的鉴定 用PCR 仪对内生真菌DNA 进行5.8S rDNA-ITS 区扩增，扩增引物为通用ITS 引物：ITS1 5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG3'，ITS4 5'TCCTCCGCTTATTGAATGC3'。PCR 扩增反应体系与扩增程序按照本研究组前期发表文献方法进行[20-21]。扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行凝胶电泳实验，1×TAE 电泳液，电压为5 V·cm－1，以2000 bp的DNA Marker 作为对照，电泳时间为22 min。完成电泳后，用EB 溶液对琼脂糖凝胶进行染色，然后放入凝胶成像系统中观察，选择在550 bp 附近有明亮、单一基因条带的样品测序，得到的测序结果在GenBank 数据库中进行BLAST 比对分析。

3 结果

3.1 白花蛇舌草内生真菌的鉴定

将测序结果与GenBank 数据库中的基因序列进行比对，对真菌进行鉴定。结果表明，共从白花蛇舌草植株中分离得到11 株内生真菌，分属于4 个不同的属，其中镰刀菌属4 株（Y-1、Y-2、Y-4、Y-9），白杯丝座孢属5 株（Y-3、Y-6、Y-7、Y-8、Y-10），尾孢属1 株（Y-5），链格孢属1 株（Y-11）（见表1）。以镰刀菌属和白杯丝座孢属真菌为主。从菌株来源部位来看，从茎中共分离得到8 株真菌，从叶中得到2 株真菌。从根部仅得到1 株链格孢属真菌，且在茎和叶中均未发现。由此说明，白花蛇舌草茎中真菌种类相对于叶和根更加丰富。

表1 白花蛇舌草内生真菌鉴定结果Tab 1 Identification results of the endophytic fungi from Hedyotis diffusa

3.2 白花蛇舌草内生真菌系统发育分析

将得到的菌株用MEGA 7.0 软件，采用最大似然法构建系统发育树（见图1）。通过分析系统发育树可以发现，尾孢属和链格孢属同源支持率达到了100%。基于5.8S-ITS 序列构建的系统发育树显示，供试菌株Y-3/6/7/8/10 与白杯丝座孢属中的Xepicula leucotricha聚在同一个分支上，其节点支持率达到100%，供试菌株Y-1/2/4/9 与镰刀菌属的菌株聚集在两个分支上，其中Y-9 与Fusarium proliferatum处于同一分支上，节点支持率为100%，Y-1/2/4 与镰刀菌属中Fusarium chlamydosporum、Fusarium equiseti聚集在同一个分支上，遗传距离较近，节点支持率为100%。根据分子系统学分析表明，镰刀菌属的4 株供试菌株间的差异性较大，而白杯丝座孢属的5 株供试菌株种间差异较小。

图1 以最大似然法构建的系统发育树Fig 1 Phylogenetic tree constructed by Maximum Likelihood method

4 结论与讨论

本研究首次对白花蛇舌草的内生真菌进行了分离与鉴定，共从白花蛇舌草植株中分离得到11株内生真菌，经鉴定为分属于4 个不同的属，其中以镰刀菌属和白杯丝座孢属为主，分离得到的内生真菌种群结构较为单一。考虑到实验过程中分离菌种仅采用了PDA 培养基，可能会造成一些可培养真菌未能成功培养。因此，本课题组于2019年7月再次采集了该产地人工栽培的白花蛇舌草样品，分别采用麦芽浸膏培养基（Malt Extract Agar Medium，MEA）、孟加拉红培养基（Rose Bengal Agar Medium，RBA）、察氏培养基（Czapek Dox Agar Medium，CDA）和高氏一号培养基（GAUZE's Medium NO.1，GSA）对其内生真菌进行了二次分离。结果仅分离得到6 株内生真菌，经鉴定仍隶属于镰刀菌属（2 株）、白杯丝座孢属（2 株）、链格孢属（1 株）和尾孢属（1 株）4 个不同的属。以上结果表明，该地区人工栽培白花蛇舌草中可培养的内生真菌种类较为单一。

尽管本研究后期对实验结果进行了重复，但得到的真菌菌群结构仍相对单一。分析其可能的原因如下：

其一，白花蛇舌草植株较小，在进行表面灭菌时，灭菌不彻底会造成外源真菌混入，而严格的表面灭菌又可能杀死一些内生真菌，最终导致真菌种类较少。因此，针对不同的植物样本，应探索与之适应的表面灭菌方法。

其二，植物中存在一些对营养物质有特殊需求的内生真菌，在进行内生真菌的分离时采用的培养基种类较少的情况下，有些内生真菌无法培养得到。而有些内生真菌本身生长缓慢，在分离时易被忽视。此外，植物中还可能有一些不可培养的内生真菌。在实验中，为了尽可能多地获取植物内生真菌，需要采用种类更多、营养更全面的培养基。

其三，不同生长环境、不同发育阶段、不同组织部位的植物样品中内生真菌结构也会存在差异，因此，为了充分挖掘植物内生真菌资源，还应该在不同生长环境、不同生长发育阶段，取植物不同的组织部位分离其内生真菌。

最后，有些植物内生真菌自身种群结构本不丰富，因此分离得到的菌种较为单一。近年来，随着白花蛇舌草需求量的增加以及野生资源的逐渐减少，人工栽培成为解决其资源问题的重要途径。河南省确山县人工栽培白花蛇舌草规模大、产量高，已成为河南省大宗药材之一。药用植物内生真菌能够促进药用植物生长、对抗环境胁迫、药效物质积累等，在多个方面对药用植物的品质形成具有重要的生态效应。因此，白花蛇舌草植株体内的内生真菌种群结构与其药材品质之间的关系值得进一步研究。总之，本研究首次对河南确山县人工栽培白花蛇舌草的内生真菌进行了分离鉴定，初步探讨了其内生真菌种群结构，为后续探讨白花蛇舌草内生真菌与药材品质相关性，以及挖掘内生真菌次生代谢产物等研究奠定了基础。