两种黄酮小分子与人血清白蛋白相互作用的研究

李淑娟，李红俊，吕晓东，姚彩红，周 莎

(宁夏计量质量检验检测研究院(国家煤化工产业计量测试中心)，宁夏 银川 750411)

黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，广泛存在于高等植物的根、茎、叶、花、果实等中，大多都以O-糖苷的形式出现。黄酮类化合物具有抗肿瘤[1]、抗氧化[2]、抗病毒[3]、抗炎[4]、保护心血管[5]、免疫调节[6]和对艾滋病病毒 (HIV) 有很强的抑制增殖作用[7]等多种生理活性和药理作用。蛋白质是药物发挥药效的重要载体和靶分子，探讨具有药理活性的天然产物与蛋白质的相互作用作用机理，对于了解药物发挥药效的作用机制，揭示药物药效的实质内涵具有重要意义。人血清白蛋白(HSA)可以运输和储存脂肪酸、氨基酸、类固醇激素、金属离子及许多内源性和外源性物质，同时维持血液正常的渗透压[8]。已报道的有芹菜素、地念黄酮类化合物、橙皮苷、贝加因黄酮、葛根素、山奈素等黄酮与血清白蛋白的相互作用，然而还未见报道异甘草甙、新异甘草甙与血清白蛋白的作用。

异甘草甙(Isoliquiritin)与新异甘草甙(Neoisoliquiritin)是两种药效较强的O-糖苷查尔酮(如图1所示)黄酮类化合物，本文采用荧光光谱法研究这两种化合物与人血清白蛋白 (HSA) 的相互作用。

图1 异甘草甙(1)和新异甘草甙(2)的分子结构式Fig.1 Molecular structure of Isoliquiritin(1) and Neoisoliquiritin(2)

1 实 验

1.1 主要仪器与试剂

仪器：RF-5301 PC荧光分光光度计，日本Shimadzu公司；F-4600 FL荧光分光光度计，日本Hitachi公司；pHS-3C型酸度计，上海雷磁仪器厂；国华HH-6数字恒温水浴，江苏常州国华电器有限公司。

试剂：异甘草甙和新异甘草甙(纯度≥98%)，上海源叶生物科技有限公司；人血清白蛋白HSA，相对分子质量以66478计，sigma公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、NaCl、HCl等均为分析纯试剂；实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

HSA溶液：用水配成1.0×10-5mol/L，0～4 ℃ 冰箱内保存；异甘草甙和新异甘草甙溶液：用无水乙醇配成0.5×10-4mol/L溶液；pH 7.4的Tris-HCl 缓冲溶液：0.05 mol/L Tris-0.15 mol/L HCl-0.50 mol/L NaCl的混合溶液。

在10 mL容量瓶中依次加入一定量的异甘草甙/新异甘草甙溶液和0.5 mL HSA溶液，用缓冲溶液稀释定容，摇匀，分别恒温静置一段时间，然后固定 λex=280 nm，选定激发和发射狭逢均为10 nm， 扫描样品在288～480 nm之间的荧光光谱；固定Δλ=15 nm或Δλ=60 nm，记录异甘草甙/新异甘草甙与HSA作用的同步荧光光谱；室温下分别扫描HSA和HSA与异甘草甙/新异甘草甙的三维光谱，扫描间隔10 nm，激发和发射狭逢均为10 nm。

2 结果与讨论

2.1 异甘草甙、新异甘草甙对HSA的荧光猝灭光谱和猝灭机制

2.1.1 荧光猝灭光谱

不同浓度的异甘草甙、新异甘草甙对 HSA 的荧光猝灭光谱见图2。由图2可知，异甘草甙和新异甘草甙在水溶液中几乎不发射荧光，但其分别加入到 HSA 中会引起 HSA 的内源荧光强度有规律地降低。同时，新异甘草甙的加入还导致 HSA 的特征发射波长产生了微弱蓝移。该结果表明，异甘草甙、新异甘草甙均与 HSA 存在着相互作用。

图2 不同浓度的异甘草甙、新异甘草甙对HSA的荧光猝灭光谱Fig.2 Fluorescence quenching spectra of HSA at different concentrations of isoliquiritin and neoisoliquiritin (pH=7.4, T=298 K, λex=280 nm)

2.1.2 猝灭机制

荧光猝灭根据猝灭方式的不同，可分为静态猝灭和动态猝灭两种。为了确定猝灭类型，运用Stern - Volmer方程[9]对数据进行处理。

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

式中:F0和F分别为猝灭剂加入前后体系的荧光强度；Kq为猝灭常数，单位是L/(mol·s)；KSV为双分子猝灭过程常数，单位为 L/mol；τ0为无猝灭剂时荧光分子的平均寿命，生物大分子的荧光平均寿命约为10-8s；[Q]为猝灭剂浓度，单位是L/mol。

以F0/F对的[Q]作图得到Stern-Volmer曲线图，猝灭参数见表1。结果表明：异甘草甙、新异甘草甙与HSA 相互作用的KSV均随着温度的升高而降低，且Kq值远大于动态猝灭中各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数2×1010L/(mol·s)，由此可以初步推断，异甘草甙、新异甘草甙对HSA的荧光猝灭可能是与 HSA 结合形成了新的基态复合物而引起的静态猝灭过程[10]。

表1 不同温度下异甘草甙、新异甘草甙与HSA相互作用的Stern-Volmer猝灭参数和结合参数Table 1 Stern-volmer quenching constants and binding parameters for interaction of HSA with isoliquiritin and neoisoliquiritin at different temperatures

2.2 结合常数和结合位点数的确定

当药物小分子与白蛋白结合的位点数n和结合常数Kb可根据表达式[11]log(F0/F-1)=logKb+nlog[Q]求算。通过log(F0-F)/F对log[Q]的作图，可得到298，305，312 K下的结合常数Kb和作用位点数n，结果见表1。结果表明：异甘草甙、新异甘草甙在HSA上都仅有一个结合位点；随着温度升高，异甘草甙和HSA的结合常数Kb逐渐升高。而新异甘草甙与HSA 的结合常数Kb逐渐降低，进一步证明新异甘草甙与HSA的荧光猝灭类型为静态猝灭。

2.3 异甘草甙、新异甘草甙与HSA结合反应的热力学性质及作用力

分子间的作用力包括氢键、范德华力、静电引力、疏水作用力等，根据 Van’t Hoff 公式[12]：lnKA=-ΔH0/RT+ ΔS0/R，以lnKA对 1/T 作图，得异甘草甙与 HSA 相互作用的方程为lnKA=-15.71+8075.57/T；新异甘草甙与 HSA 相互作用的方程为lnKA=21.14-3024.68/T；根据热力学公式分别求出ΔH°、ΔS° 和ΔG°，结果见表1。异甘草甙与HSA 作用的ΔH°<0且ΔS°<0，表明异甘草甙与HSA相互作用力主要是氢键或范德华力。新异甘草甙与HSA作用的ΔH°>0且ΔS°>0，表明新异甘草甙与HSA相互作用力主要是疏水相互作用。异甘草甙、新异甘草甙与HSA相互作用的ΔG°<0，说明两个化合物与HSA的相互作用过程一个吉布斯自由能降低的自发过程。

2.4 异甘草甙、甘草甙对HSA 构象的影响

Δλ=15 nm所作同步荧光光谱显示酪氨酸残基的光谱特征，而Δλ=60 nm的同步荧光光谱仅显示色氨酸残基的光谱特征。根据实验结果，随着异甘草甙浓度的增加，酪氨酸残基荧光强度降低但发射波长未出现明显移动，色氨酸残基的荧光强度降低且最大发射波长红移，由此可知异甘草甙对 HSA 的荧光猝灭主要是相互作用后导致色氨酸残基所处的微环境疏水性降低，极性增加，影响了荧光强度。随着新异甘草甙浓度的增加，酪氨酸残基和色氨酸残基的最大发射波长均发生红移，表明新异甘草甙与 HSA 的作用改变了酪氨酸和色氨酸残基所处微环境的极性，疏水性降低，导致 HSA 的结构变得疏松。

进一步采用三维荧光光谱考察了异甘草甙、新异甘草甙对 HSA 构象的影响。没有加入猝灭剂时时HSA的(λex/λem, F)是(280.0/330.0, 616.8)；向HSA中加入异甘草甙后，HSA的(λex/λem, F)是(280.0/320.0, 401.6)，荧光峰强度降低了215.2，HSA的荧光峰蓝移10 nm；向HSA中加入新异甘草甙后，HSA的(λex/λem, F)是(280.0/310.0, 327.8)，荧光峰强度降低了299.0，HSA的荧光峰蓝移20 nm。很明显，异甘草甙和新异甘草甙对HSA的荧光均有猝灭作用，但是新异甘草甙对HSA的猝灭作用更强。结合同步荧光的分析结果，异甘草甙与HSA的结合部位主要在色氨酸残基所处的疏水腔中，新异甘草甙与HSA的结合部位可能处于酪氨酸和色氨酸残基所处疏水腔中，从而引起疏水腔微环境极性的改变，进而导致了HSA构象的变化。

从异甘草甙和新异甘草甙的结构来看，两个化合物的双键O均和A环中的2位羟基H形成了很强的分子内氢键，氢键的形成在一定程度上增加了体系的稳定性；异甘草甙是B环上4′位羟基与葡萄糖形成的黄酮苷，新异甘草甙是A环上4位羟基与葡萄糖形成的黄酮苷，并结合异甘草甙、新异甘草甙与 HSA 的作用力不同，及对 HSA 构象的影响，发现新异甘草甙使HSA蓝移程度更大，可能是B环上4′位羟基影响的结果[13]，据此推断新异甘草甙可能具有比异甘草甙更强的抗氧化能力。

3 结 论

本文首次应用荧光猝灭法、同步荧光光谱法和三维荧光光谱法研究了O-糖苷查尔酮黄酮类化合物异甘草甙、新异甘草甙与HSA的相互作用。结果表明：异甘草甙、新异甘草甙对HSA的内源荧光都有猝灭作用，猝灭类型都为静态猝灭，结合为点数n≈1。异甘草甙与HSA相互作用力主要是氢键或范德华力；新异甘草甙与 HSA相互作用力主要是疏水相互作用。同时利用同步荧光光谱和三维荧光光谱探讨了对HSA构象的影响。新异甘草甙使HSA蓝移的程度更大，推测可能是B 环上4′位羟基影响的结果，根据实验结果和文献推断新异甘草甙可能比异甘草甙具有更强的抗氧化能力。本文所获结果可以为更深入地了解黄酮与血清蛋白的作用机制，改造黄酮小分子，寻找新的药物小分子提供有价值的信息。