艾灸对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织TLR4/NF-κB信号通路影响

卢曼晨，庞静雯

（安徽中医药大学，合肥 230000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis， RA）是一种以对称性、侵蚀性滑膜炎为主要病理学特点的慢性、炎症性、系统性自身免疫疾病。临床以关节肿胀、疼痛为主要表现，甚者可至关节破坏、畸形和功能障碍，影响患者健康和生活质量。该病发病机制尚不明确，病情反复且病程缠绵，研究证实其与自身免疫系统关系密切，同时与炎性因子密切相关[1-3]。近年来的研究表明，RA与局部某些信号通路的激活或抑制有关，Toll 样受体 4/核因子-κB（Toll-like receptor 4/nuclear factor κB， TLR4/NF-κB）信号通路在 RA的发生发展中扮演着重要角色，研究发现RA患者的滑膜组织、免疫细胞等都存在TLR表达的改变[4]。

在现代研究中，佐剂性关节炎（adjuvant arthritis， AA）大鼠模型与RA病理特点相似，常作为研究RA发病和治疗的动物模型。AA大鼠模型是在20世纪50年代由细菌学家Freund创立，又称弗氏佐剂关节炎，以炎细胞浸润、软骨破坏、基因连锁等为特点，被广泛应用于 RA相关研究[5]。有研究表明，艾灸“足三里”等穴可通过调节细胞因子、提高局部痛阈等途径来缓解滑膜炎症和关节疼痛[6-8]。本研究从艾灸的抗炎免疫效应出发，观察 TLR4/NF-κB信号通路在 AA模型大鼠滑膜炎症和滑膜细胞增殖中的作用，探讨艾灸通过 TLR4/NF-κB途径改善关节滑膜组织局部炎症的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及其分组

健康雄性SD大鼠30只，由安徽省实验动物中心提供，许可证号为 SCXK（皖）2017-001，体质量（250±20）g，适应性喂养 1周后，按照《卫生统计学》[9]随机数字表随机分为正常组、模型组和艾灸组，每组10只。各组大鼠12 h明暗交替、（25～28）℃环境饲养，每日添加水食。实验过程中严格遵循中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定对动物进行处置。

1.2 主要试剂与仪器

完全弗氏佐剂 （SLBW7430，Sigma）， 水合氯醛（20180305，国药集团化学试剂有限公司），异丙醇（20160614，上海苏懿化学试剂有限公司），DEPC-H2O（D1007， Generay Biotech），大鼠 IL-1β ELISA 试剂盒（I05018350， Cusabio），大鼠 TNF-α ELISA 试剂盒（G22018349， Cusabio），Trizol（15596026， Life technogies）， 逆转录试剂盒 （K1622， Thermo Scientific），无水乙醇、二甲苯（国药集团），苏木素（BA-4097，贝索试剂），伊红（BA-4099，贝索试剂）。趾容积测量仪（成都泰盟软件有限公司），酶标仪（Molecular Devices， SpectraMax M2e），GL-88B 漩涡混合器（其林贝尔仪器制造公司），倒置荧光显微镜（日本尼康 Nikon Ti），石蜡切片机（RM2245，德国 Leica），普通PCR仪（K960，杭州晶格科学仪器有限公司），荧光定量 PCR 仪（PIKOREAL 96， Thermo Scientific），微孔板迷你离心机（MINI-P25，杭州奥盛仪器有限公司）。

1.3 模型制备

AA大鼠模型构建参考文献方法[10]，模型组和艾灸组大鼠皮下注射完全弗氏佐剂（complete freund's adjuvant， CFA）。用75%乙醇溶液对左后足消毒，按每只0.1 mL的剂量进行皮下注射CFA，观察3 d。左后肢出现不同程度的红肿、结节和活动受限表示模型成功。正常组大鼠不作任何处理。

1.4 干预方法

艾灸组参照《实验针灸学》[11]的动物穴位图谱取“足三里”穴，于造模后第4天开始采用直径0.9 cm纯艾条（南阳市卧龙汉医艾绒厂）对大鼠左后肢“足三里”穴进行温和灸，艾条距离皮表2 cm，每次20 min，每日1次，连续灸15 d。正常组和模型组大鼠于艾灸组干预的同时间段仅进行抓取，并固定在特制的悬空木架上，不做任何干预，每次固定20 min，每日1次，连续15 d。

1.5 检测指标

1.5.1 足趾关节肿胀度

末次干预后次日，使用足趾容积测量仪测量 3组大鼠左后足趾容积。于大鼠踝关节处做标记，使用足趾容积测量仪测量大鼠左后肢足趾容积，连测 3次取平均值，作为评估各组足趾关节肿胀度的数据。

1.5.2 大鼠滑膜组织形态学观察

末次干预后次日，采用 10%水合氯醛溶液进行腹腔注射麻醉（每100 g体质量注射0.3 mL）后处死，取左后肢足趾关节组织若干块（每块大小0.5 cm3），立刻固定于4%多聚甲醛溶液中12 h，经梯度乙醇溶液脱水，石蜡包埋，组织切片机切片，40℃～45℃水浴锅展片、贴片，经脱蜡至水后，切片放入苏木精中染色约2 min。用清水洗涤、分化、漂洗、分别用低浓度到高浓度的乙醇溶液脱水，滴加 0.5%伊红乙醇溶液 0.2 mL，静置1～3 min，再将切片放入无水乙醇1 min左右，最后放入95%乙醇溶液，直到无红色染料残留。将切片浸入二甲苯溶液中3～5 min，滴加中性树胶0.5 mL，于阴凉处静置凝固，显微镜下观察滑膜组织形态结构。

1.5.3 趾关节滑膜组织IL-1β、TNF-α含量检测

按上法处死大鼠，取左后肢足趾关节滑膜组织 100 mg，剪碎，液氮研磨，加入 1 mL生理盐水匀浆， 3000 r/min离心15 min，再取上清液，液氮速冻，-80℃保存备用。检测时，从-80℃冰箱中取出关节液梯度复温融化，试剂盒在室温中平衡20 min后，按酶联免疫吸附法（ELISA）说明书中的步骤进行标准品（S0-S6）制备、加样、抗体孵育等操作，加入终止液后用酶标仪在450 nm波长检测每孔光密度值（OD值）。由S0-S6的OD值和浓度绘出标准曲线和标准方程，将每孔OD值代入标准方程求出每个样本IL-1β和TNF-α的浓度。

1.5.4 趾关节滑膜组织IκB激酶复合物（IκB kinase complex， IκK）β 、 NF-κBp65 、 NF-κB 抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor kappa B kinase， IκB）α、髓样分化因子 88（myeloid differentiation factor88， Myd88）、TLR4 mRNA 检测

按上法取大鼠左后肢关节足趾关节滑膜组织100 mg，剪碎，液氮研磨，加入1 mL TRIzol匀浆。用4℃离心机12 000 r/min离心匀浆10 min，保证脂肪和组织被去除。取上清液于离心管（eppendorf， EP）中，加入0.2 mL氯仿溶液，剧烈震荡EP管15 s，室温静置3 min后，将液体用4℃离心机12 000 r/min离心15 min，取0.5 mL上清液加入另一EP管中，再向EP管中加入0.5 mL异丙醇溶液，轻轻颠倒几下混匀，室温静置10 min，用4℃离心机12 000 r/min离心10 min，用移液器吸去上清液。向沉淀中加入1 mL 75%乙醇溶液[用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate， DEPC）处理过并经高温高压灭菌的超纯水配制]，轻柔吹打混匀，用4℃离心机12 000 r/min离心5 min，轻轻吸去上清液。于阴凉处室温放置30 min，待RNA沉淀干燥。向沉淀中心加 20 μL DEPC水，放置在 55℃水浴锅中 10 min，-80℃保存备用。将总 RNA（质量为 1 μg）加入0.2 mL的EP管中，再加入10 μm寡聚胸腺嘧啶引物[Oligo（dT）]1 μL，加入 DEPC 水将管内液体体积补足至12 μL后，轻轻弹EP管壁混匀、点动离心。然后用PCR仪加热5 min，温度设置65℃，加热结束后立即冰浴3 min。按照试剂盒说明，在上述EP管中加入相关缓冲液和预混溶液。放置PCR仪中，设置程序，取出上述反应液保存备用。取出cDNA作为荧光定量的模板，按照反应体系，在相应反应条件下进行40个循环。各检测指标引物详见表1。

表1 各检测指标引物序列

1.6 统计学方法

采用SPSS21.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示；多组间比较采用单因素方差（one-way ANOVA）分析；若方差齐，组间两两比较采用LSD法，若方差不齐则采用Games-Howell分析。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠左后肢足趾容积比较

与正常组比较，模型组中大鼠足趾容积明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，艾灸组大鼠足趾容积明显降低（P＜0.01）。表明艾灸可明显缓解AA大鼠足趾肿胀。详见图1。

图1 3组大鼠左后肢足趾容积比较（n=10）

2.2 3组大鼠滑膜组织形态学比较

正常组大鼠的滑膜细胞大多排列较为规则，呈现单层形态，未观察到炎细胞浸润，滑膜表面平滑整齐；模型组大鼠滑膜细胞出现增生，组织中可见大量炎细胞浸润，滑膜表面细胞排列不整齐；艾灸组与模型组比较，炎细胞浸润减少，滑膜细胞的增生情况缓解。详见图2。

图2 3组大鼠滑膜组织形态学比较（HE染色，×400）

2.3 3组大鼠滑膜组织中IL-1β和TNF-α浓度比较

与正常组比较，模型组大鼠滑膜组织中 IL-1β和TNF-α的浓度均升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，艾灸组IL-1β和TNF-α的浓度均降低（P＜0.01）。详见图3。

图3 3组大鼠滑膜组织中IL-1β和TNF-α的浓度比较（n=10）

2.4 3组大鼠滑膜组织中TLR4和Myd88 mRNA的表达比较

与正常组比较，模型组大鼠滑膜组织中 TLR4、Myd88 mRNA表达量均升高，组间差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，艾灸组大鼠滑膜组织中TLR4、Myd88 mRNA表达量均降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。详见图 4。

图4 3组大鼠滑膜组织中TLR4和Myd88 mRNA的表达比较（n=10）

2.5 3 组大鼠滑膜组织中 NF-κB p65、IκBɑ和IκKβ mRNA 的表达比较

与正常组比较，模型组大鼠滑膜组织NF-κB p65、IκBα和 IκKβ mRNA的表达均升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，艾灸组大鼠 NF-κB p65、IκBα和 IκKβ mRNA的表达量均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。详见图 5。

图5 3 组大鼠 NF-κB p65、IκBα、IκKβ mRNA 的表达比较（n=10）

3 讨论

类风湿关节炎是一种病因尚未明确的慢性、进行性、侵蚀性自身免疫性疾病，特征性表现为滑膜炎。IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子、炎性抗体以及 T、B细胞在该病发展过程中起着重要作用[12]。其中IL-1β、TNF-α在患者血浆中高表达，发病过程中主要诱导内皮细胞表达黏附分子（ICAM-1），导致局部炎症，抑制糖蛋白合成导致骨和软骨的破坏，且二者具有显著的正相关关系[13-14]。NF-κB信号通路与机体炎症反应密切相关，可调控包括 IL-1β、TNF-α等多种促炎因子的表达，并在RA患者疾病过程中参与滑膜组织增生、骨组织破坏等[15-17]。NF-κB信号通路由包括 NF-κB家族、IκB和IκK等因子组成。NF-κB家族在RA实验研究中最常见的是p50和p65两个亚单位构成的一种异源二聚体；IκBα是 NF-κB 抑制蛋白之一，可与 NF-κB p65 蛋白结合，定位于细胞质中；IκB激酶能够特异磷酸化IκBα，启动基因转录活化NF-κB，是多种肿瘤、炎症发生发展的重要因素[18]。在炎症反应中，参与免疫系统对微生物识别的受体家族 TLRs也会被激活。研究表明，TLR2、TLR4参与早期RA的发生、发展，通过识别后的 TLR4可磷酸化 IκB蛋白，促进其降解，级联反应激活 NF-κB，信号转移至细胞核中，从而发挥其调控炎症作用[19-21]。Myd88处于 TLR信号通路的下游，NF-κB信号通路可使 TLR通过 Myd88途径激活，合成并释放TNF-α、IL-1β等相关炎症介质 ，完成炎性反应信号的传递[22-23]。

因此TLR4/NF-κB信号通路在对RA治疗机制研究中具有较高价值。本实验亦证实AA模型大鼠滑膜细胞炎性增殖严重，滑膜组织 TNF-α、IL-1β的水平上升明显，NF-κB p65 蛋白、IκBα、IκKβ、TLR4、Myd88 mRNA表达水平均显著高于正常组，提示TLR4/NF-κB信号通路的活跃与AA滑膜炎和滑膜细胞增殖有密切联系。

艾灸具有温通气血、培补元气的作用[24]，对缓解RA患者临床症状、减轻痛苦、既病防变方面有显著作用。研究表明，艾灸具有抑制RA滑膜细胞异常增殖和微血管增生，减轻炎症反应和缓解疼痛等作用[25-29]。文献研究显示足三里穴是 RA针灸治疗中的首选穴位[30-31]。足三里穴位于足阳明胃经，主治胃肠病证、下肢痿痹、虚劳诸证等，具有强壮作用，是保健要穴。临床研究发现艾灸配伍足三里穴区治疗 RA的总有效率超过95%[32-33]。

本研究发现艾灸AA模型大鼠足三里穴区，能够减轻足趾关节肿胀、缓解滑膜细胞增殖，并降低滑膜组织IL-1β、TNF-α、IκBα、IκKβ、NF-κB p65、Myd88、TLR4 mRNA水平，提示艾灸能有效改善AA大鼠滑膜炎症状，并抑制TLR4/NF-κB信号通路的活跃状态。因此，抑制 TLR4/NF-κB信号通路可能是艾灸发挥抗炎消肿作用的效应机制之一。然而，本研究虽证实TLR4受体成功识别后可级联反应激活NF-κB通路，导致IL-1β、TNF-α等炎性因子释放增加，但是由于缺少 TLR4特异性激活与拮抗对照观察，未能充分阐释二者内在关系，下一步需要开展 TLR4与NF-κB信号通路之间的关联性研究，以及灸法的效应因素与该通路的相关响应靶点的关系，以期进一步揭示艾灸的抗炎免疫效应机制。