循环游离DNA甲基化模式分析在心肌梗死中的研究进展

王锋?丁艳?张焕基

【摘要】循环游离DNA（cfDNA）是循环体液中游离状态的DNA，其在体内的释放被认为与细胞的坏死、凋亡等相关。近年来cfDNA甲基化检测作为一种“液体活组织检查”技术已成为疾病诊疗中的研究热点。心肌梗死后外周血循环中cfDNA的含量升高，并发现cfDNA升高与心肌梗死后并发症的发生有相关性。近年来通过甲基化模式分析寻找到心肌细胞特异性的cfDNA，使cfDNA检测能够为心肌梗死提供更多客观的评估证据。该文综述近几年国内外cfDNA甲基化模式分析在心肌梗死中的研究进展。

【关键词】循环游离脱氧核糖核酸;甲基化;液体活组织检查;心源性游离脱氧核糖核酸;

心肌梗死

Research progress on circulating cell-free DNA methylation pattern analysis in myocardial infarction Wang Feng， Ding Yan， Zhang Huanji. Department of Cardiology， the Eighth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Shenzhen 518033， China

Corresponding author， Zhang Huanji， E-mail： huanji13688808979@ 163. com

【Abstract】Circulating cell-free DNA （cfDNA） is the free DNA existing in circulating blood， and its release is related to cell death and apoptosis， etc. In recent years， cfDNA methylation detection， as a “liquid biopsy” technique， has become a hot research topic in the diagnosis and treatment of diseases. The content of cfDNA is increased in the peripheral blood circulation after myocardial infarction， which has been proven to be correlated with the occurrence of complications after myocardial infarction. Through the analysis of cfDNA methylation pattern， cardiomyocyte-specific cfDNA can be identified， providing more objective evaluation evidence for myocardial infarction. In this article， recent research progress on cfDNA methylation pattern analysis in myocardial infarction at home and abroad was reviewed.

【Key words】Circulating cell-free deoxyribonucleic acid;Methylation; Liquid biopsy;

Cardiomyocyte-specific cell-free deoxyribonucleic acid;Myocardial infarction

循环游离DNA（cfDNA）是指存在于循环体液中的游离DNA片段，近年来被广泛应用于肿瘤诊疗、无创产前诊断、免疫系统疾病诊疗等领域[1-2]。cfDNA在人体中广泛存在，除了存在于外周血液中，还可在脑脊液、尿液等循环体液中被检测到[3]。cfDNA的来源途径有多种，除了病理状态下（如肿瘤、炎症、免疫反应）可产生cfDNA，运动、衰老、心理应激等生理状态也可导致cfDNA的释放[4]。当组织器官发生损伤时，坏死细胞可释放大量的cfDNA到循环体液中。心肌梗死伴随着大量的心肌细胞坏死，可在患者血浆中检测到cfDNA的水平明显升高。但血浆中cfDNA含量是否可以作为心肌梗死的观察指标，这个问题一直存在着争议，主要原因在于以往的研究并未能明确cfDNA的组织细胞来源。近年来随着cfDNA甲基化模式分析作為一种新型“液体活组织检查”技术在疾病诊疗的火热开展，除了可对cfDNA含量进行检测外，还可对其甲基化模式分析等来获取更多疾病信息[5-6]。目前通过甲基化模式分析寻找到心肌细胞特异性的cfDNA，并发现这种心源性cfDNA在心肌梗死的诊断中具有独特的优势。现综述cfDNA及甲基化模式分析在心肌梗死中的研究进展。

一、心肌梗死后外周血中cfDNA含量升高

以往的研究显示，心肌梗死患者血循环中cfDNA含量显著增加，与心肌细胞的凋亡和坏死有关。Chang等[7]发现心肌梗死患者血浆中cfDNA含量[（511±389）ng/ml]是健康人群[（36.3±23.8）ng/ml]的10倍。Destouni等[8]通过连续5 d监测心肌梗死患者血浆中cfDNA与健康人群cfDNA的含量，同样发现心肌梗死组的cfDNA均保持在10倍的水平。但是心肌梗死后，cfDNA在血中的升高幅度并没有明确的定论，有研究结果则显示心肌梗死患者的cfDNA是健康人的5倍，并且冠状动脉性心脏病患者血中的cfDNA也要比健康人高[9-11]。

心肌梗死患者血浆中cfDNA的升高可能还与心肌梗死后并发症的发生具有相关性。有学者根据有无心肌梗死并发症将患者分为2组，可观察到发生并发症的患者血浆cfDNA最大中位值水平是无并发症事件组的3.5倍[8]。另一项研究结果显示伴发心力衰竭或再发梗死患者血浆中cfDNA比对照组升高2倍，而伴发心源性猝死的患者cfDNA则升高3倍[12]。而cfDNA水平越高的患者，发生出院后6个月内再入院治疗的概率会越高。但有学者指出，这些研究在证明cfDNA与心肌梗死并发症的关系时，并没有考虑到其他心血管相关的危险因素（肥胖、高血压等）[13]。Vora等[14]发现，BMI水平每增加一个单位（kg/m2），cfDNA总量提高1.7%，说明肥胖等危险因素也会影响心肌梗死后患者血中cfDNA水平。虽然心肌梗死后患者血中的cfDNA水平增加，但是这些cfDNA的增加是非特异性的，cfDNA在血循环中的释放受多种因素影响。

二、甲基化模式分析寻找心肌细胞特异性的cfDNA

目前认为cfDNA的序列与细胞基因组DNA的序列相同，但相同序列的cfDNA片段可能源自受损伤组织的实质细胞，也可能来自于死亡的炎症细胞，这使得我们无法通过识别血中升高的cfDNA序列来判断其来源[3]。DNA甲基化是一种高度稳定的表观遗传修饰方式，不同的细胞类型具有特定的DNA甲基化模式[15]。当坏死或凋亡的细胞释放cfDNA到血循环时，可认为这些cfDNA甲基化模式与其来源组织细胞的甲基化模式高度一致，而其中某些甲基化模式的基因具有较高的组织细胞特异性[16]。因此，可通过分析cfDNA的甲基化模式来确定cfDNA的细胞组织来源。例如，胰岛素基因（INS）启动子区域在80%的胰腺B细胞中是非甲基化状态的，而在其他组织中是呈甲基化状态，因此可认为血中非甲基化的INS基因对B细胞具有高度特异性[17]。

为了寻找心肌细胞特异性的cfDNA，Zemmour等[18]通过分析cfDNA的甲基化模式来寻找心肌细胞特异性的cfDNA。研究人员在公开的甲基化数据库中将人类心脏中的甲基化小体与其他23种组织的甲基化小体进行了比较，鉴定出了几个存在差异的甲基化位点，并选择了一组与FAM101A位点相邻的胞嘧啶簇做分析[19]。在经过重亚硫酸氢盐转化后，通过PCR法扩增了该位点，测定该簇中6个胞嘧啶的甲基化状态。结果发现心肌细胞中FAM101A附近位点89%是非甲基化的，而在其他非心肌组织中该位点的非甲基化率< 0.2%。骨骼肌和结肠平滑肌这2种肌细胞组织中也仅有0.1% ～ 0.2%的FAM101A位点是非甲基化的，证明非甲基化的FAM101A位点具有心肌组织特异性。但是在血液循环中，大部分的DNA片段是白细胞来源的，而白细胞DNA中FAM101A位点附近非甲基化率< 0.006%，进而排除了白细胞来源的cfDNA干扰[3]。因此认为FAM101A位点的非甲基化DNA片段具有较好的心脏特异性，可选择该DNA片段作为一种反映心肌细胞损伤的心源性cfDNA来进行研究。

三、心源性cfDNA与传统心肌梗死标志物的比较

心肌梗死发生后，目前主要通过心肌肌钙蛋白（cTn）、CK-MB、肌红蛋白等传统的生物标志物来判断心肌损伤程度，其中以cTn最为敏感。心肌梗死患者会出现血循环中总cfDNA的升高，但有趣的是，血循环总cfDNA水平與cTn及CK-MB水平并不存在相关性，有研究者认为这可能与不同的指标在血中到达峰值的时间不一致有关[7， 20]。血循环总cfDNA的升高比CK-MB要早，但是到达峰值的时间却比CK-MB更晚[7]。而cfDNA到达峰值的时间比cTn要早一些[20]。此外， cfDNA并不只源自于心肌细胞，血循环总cfDNA含量反映近期机体内所有细胞坏死事件，所以会有其他组织来源的cfDNA掩盖了心脏的特异性信号。

非甲基化FAM101A作为一种心肌细胞来源的cfDNA，同样能反映心肌梗死后心肌细胞的坏死情况，并且具有较好的心脏特异性。研究者分别在ST段抬高性心肌梗死（STEMI）患者和健康人群的血液样本中检测非甲基化FAM101A在血循环中的含量，发现这种心源性cfDNA在心肌梗死患者中显著升高。然后研究者绘制了受试者工作特性（ROC）曲线，得出曲线下面积（AUC）为0.94，说明这种心源性cfDNA对心肌梗死具有较好的灵敏度和特异度。与血循环总cfDNA不同的是，在心肌梗死患者血中这种心源性cfDNA与cTn升高水平是呈正相关的，在79%的STEMI患者血中可检测到两者几乎同时升高，并且两者到达峰值的时间几乎一致[18]。

cfDNA的代谢途径与cTn并不相同，cTn主要是通过肾脏来代谢，所以肾功能不全时会使 cTn 的代谢出现异常，此时会影响其对心肌损伤的诊断价值[21]。cfDNA主要是通过肝脏代谢，且在体内的代谢速率比cTn快[3]。当冠状动脉血运成功重建后，心脏再灌注会引起心脏标记物的突然增高。但由于cTn的清除速率慢，在术后48 h仍可处于较高水平，因此cTn升高对48 h内的再发心肌梗死难以判断[22]。通过监测心肌梗死患者不同时间点血循环中心源性cfDNA的代谢情况，也可发现PCI术后患者血中心源性cfDNA的水平要比术前高，但在术后1 ～ 2 d内能更快的回到基线水平，清除速率比cTn快。这种在血中快升快降的代谢动力学特性说明心源性cfDNA对再发心肌梗死的判断会比cTn更加敏感。

除了在心肌梗死患者血中可出现心源性cfDNA的升高，脓毒血症和感染性休克的患者血中也可检测出心源性cfDNA的升高，这可能与心肌细胞坏死相关[18]。但是心源性cfDNA的升高与患者ALT、AST、血清肌酐水平的关系并不大，说明心源性cfDNA的升高主要反映机体感染对心肌损伤，而肝肾功能不全对心源性cfDNA的影响不大。Kaplan-Meier生存曲线结果也显示心源性cfDNA升高的脓毒血症患者在90 d内死亡风险提高4倍。但是，脓毒血症患者心源性cfDNA升高水平与cTn升高水平并不相关，这可能与肝肾功能不全时体内cfDNA与cTn清除速率不同有关。而且，cTn的升高有时并不意味着心肌细胞的坏死，短暂的缺血和应激反应造成的可逆性心肌细胞损伤，甚至是剧烈运动的健康人血中都能检测到cTn水平的升高[23]。因此，在脓毒血症和败血症等感染性疾病中，心源性cfDNA在血循环中的升高比cTn更能反映心肌细胞坏死程度，对感染性患者的心肌损伤评估更灵敏，并且对患者预后有一定的预判价值。

四、小結及展望

通过cfDNA甲基化模式分析寻找的心源性cfDNA，可给心肌梗死后的心肌损伤评估带来更多客观的证据。与传统的心肌酶谱分析不同的是，心肌细胞释放的cfDNA是来自于细胞自身携带的基因组DNA，因此cfDNA携带着丰富且多元化的基因信息。通过甲基化模式分析，能寻找到组织特异性好的cfDNA，弥补了以往无法明确cfDNA组织来源的缺陷。但是目前cfDNA检测在临床上的应用还仍然受到限制，一方面是目前的检测手段如微滴式数字PCR技术的价格成本较高，另外一方面是cfDNA检测还存在着性别、人群种族、年龄的差异，目前仍难以制定统一的标准去量化。目前除了甲基化模式分析，cfDNA羟甲基化分析逐渐成为新的研究热点[11]。此外，cfDNA甲基化模式分析除了可分析组织细胞来源外，对组织坏死引起的相关并发症以及坏死事件的预后都有着不错的评估效果[24-25]。未来是医疗大数据时代，cfDNA携带的丰富基因信息是传统血液标志物所不可比拟的。通过对cfDNA进行多种基因修饰模式分析，以及结合生物信息学分析手段，未来可为心血管疾病的诊断及预后评估带来更多客观证据。

参 考 文 献

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（收稿日期：2020-12-14）

（本文編辑：杨江瑜）