GJB2突变相关的迟发性遗传性聋研究进展

秦梦瑶 冯永 吴学文

中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科耳鼻咽喉重大疾病湖南省重点实验室（长沙 410008）

GJB2基因定位于13q11-12，全长为4804bp，编码区为678bp，由两个外显子组成，其启动子区域共有7个GC盒[1,2]，表达来源于外胚层的组织中，编码产物是缝隙连接蛋白26（Connexin26，Cx26），是耳蜗间隙连接的主要组成部分[3]。临床上，GJB2（Cx26）突变可以导致DFNB 1(隐性)和DFNA 3(显性)非综合征型耳聋，是非综合征耳聋的最常见的病因之一[4]。近年研究发现GJB2基因突变不仅引起先天性听力损失，部分患者出生时听力正常，可出现迟发性聋[5-7]。但其导致迟发性聋的潜在致病机制至今尚未完全明确，本文旨在将近年来GJB2突变相关的迟发性聋的研究进展进行综述,以期进一步探索GJB2的致聋机制与治疗措施。

1 GJB2基因突变与迟发性聋

随着遗传性耳聋的研究不断开展，越来越多的基因突变种类被发现。截止到目前，已发现共有432种GJB2基因突变，其中386种突变与耳聋相关（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=GJB2）。其突变具有一定的种族与地区差异性。c.35 delG突变多发现于欧洲和中东[8,9]；c.235 delC突变常出现在东亚[10]；p.V37I突变常见于亚洲，尤其是东南亚[11,12]；W24X突变主要分布在印度[4],其他突变如c.167 delT和p.R143W分别可见于犹太人和加纳人中[13,14]。由于GJB2基因突变位点具有多样性，并存在一定的非外显率，且基因型与听力受损外显时间存在一定的关系，GJB2的突变可表现为出生后迟发性、渐进性耳聋[6,12,15]。Chai Y团队[16]研究发现在GJB2基因的p.V37I纯合突变的听力损失人群中，先天性听力损失的发病率是65%（11/17），迟发性听力损失发病率为35%（6/17），在2012年LI团队[17]进行了流行病学研究，也证明p.V37I突变无论是复合杂合还是纯合突变，均可能导致进展的、迟发的听力损失；Pagarkar W等人[18]曾在随访中发现2例c.35 delG纯合子突变的患者，出生时听力均正常，一例在3岁左右时出现高频听力下降,另一例在6个月大时出现听力受损；Gandía M团队[19]对一个西班牙家系的研究发现，c.35 delG杂合突变及少量错义突变(p.M34T、p.V37I和p.L90P)与迟发性的轻中度感音神经性聋相关；Kecskeméti N[20]等学者也在大样本的匈牙利患者的随访中发现，c.35 delG与p.V37I的杂合突变可导致迟发性的听力受损；Petersen MB等[21]学者在一个希腊家系的研究发现GJB2基因中杂合子c.35delG突变是出现迟发性聋的原因；Minami等人[6]对924例听力受损患者行GJB2突变检测后，发现有14例携带GJB2基因突变的儿童为迟发性听力受损，出生时听力筛查均通过。以上研究表明，GJB2基因突变与迟发性聋相关，且突变种类多样（如表1）。因此，有GJB2基因突变儿童即使出生时听力筛查通过，也仍需进一步观察随访。

表1 与迟发性聋相关的GJB2基因突变Table 1 GJB2’s Mutation Associated with Late-onset Hearing Loss

2 GJB2基因致迟发性聋的可能机制

近年来，对GJB2基因突变引起遗传性聋的致病机制研究取得了一定的进展，但仍未完全阐明。既往的研究发现小鼠Gjb2基因突变所致听力损失可能与耳蜗发育障碍（包括内毛细胞的带状突触发育不良）、毛细胞变性和耳蜗内电位（Endocochlear potential,EP）减少[22-26]有关。这些研究对GJB2突变相关的先天性聋的致病机制进行了阐述，而未能清晰阐明迟发性聋的机制。

2.1 Cx26表达缺陷可引起耳蜗主动放大功能障碍并进一步导致迟发性聋

研究表明听觉的产生不仅需要有正常发育的耳蜗结构，还需要外毛细胞(Outer hair cell,OHC)的电活动和纤毛运动共同产生能动的耳蜗力学来扩大听觉刺激，提高听力灵敏度和频率选择性，OHC电活动是耳蜗主动放大器的基础，当OHC的电活动受损时可能导致耳蜗的主动放大功能减弱，出现听力损失[27,28]。2000年Zhao HB团队[29]发现小鼠内耳Deiters细胞（Deiters Cells,DCs）的机械刺激或DCs之间缝隙连接的变化均会减弱外毛细胞的电活动而出现听力受损，但研究未明确支持细胞的缝隙连接是否也会产生影响；在2013年Zhu Y等[30]靶向敲除Cx26在DCs和柱状细胞（Outer pillar cells,OPCs）中的表达，发现Cx26的缺乏限制了基底膜上的OPCs功能，导致OHC的电动力在超极化方向上向左移动，减少耳蜗的主动放大，出现听觉脑干反应（Auditory brainstem response,ABR）与畸变产物耳声发射（Distortion product otoacoustic emission,DPOAE）阈值的逐渐升高，证明耳蜗主动放大功能依赖支持细胞间隙连接；两年后该团队[31]采用时间控制的诱导基因敲除技术在小鼠出生后第10天敲除耳蜗中Cx26的表达，小鼠出现类似于临床迟发性聋的听力表现。在研究中用双正弦法测量OHC的电动力相关非线性电容(Non-linear capacitance,NLC)时发现其在去极化方向向右移动，电压依赖的斜率减小，而OHC电动力的右移是可以减少耳蜗主动放大功能的[32]。研究还发现随着时间推移，ABR阈值逐渐升高，但EP下降并不明显，进行免疫荧光染色后发现耳蜗内Cx26几乎无标记，但小鼠耳蜗发育正常，耳蜗隧道正常开放，亦无明显毛细胞脱落。这些数据提示Cx26缺乏导致的迟发性听力损失可能与耳蜗主动放大功能受损有关，而不是细胞变性脱落、耳蜗发育障碍及EP下降的结果；2017年Zong L等人[33]在证明以上机制的同时，进一步研究发现听力损失和耳蜗主动放大的受损程度是逐渐发展的，随着年龄的增长，听力损失从高频区扩展到低频区，而且在高频区和低频区的损失程度存在差异。可见，Cx26缺乏可能导致OHC电活动向左或向右位移，降低耳蜗主动放大功能，出现迟发性听力受损，且受损程度随着时间的推移逐渐进展。

2.2 GJB2基因突变可能通过改变氧化应激水平加速迟发性聋的进展

氧化应激影响机体许多系统的缝隙连接蛋白表达和缝隙连接通道功能，缝隙连接蛋白功能异常时，氧化应激增加可以加重听力受损[34]。2018年Fetoni AR等[35]学者对迟发性聋的机制进行了补充，其团队对携带c.35 delG杂合子突变的Gjb2+/-小鼠进行听力测试，观察到从2个月龄开始，有基因突变小鼠的ABR和DPOAE阈值逐渐增加，出现迟发性的听力损失；他们进一步研究发现小鼠内耳的Cx26部分缺乏，导致间隙连接网络对上皮细胞的营养传递减少，使核因子红质相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)这一耐受氧化还原应激的关键调节因子的转录不能正常进行，出现Nrf2通路的功能障碍，氧化还原平衡失调，耳蜗的抗氧化功能减弱，氧化应激增加，加速耳蜗的老化，出现与年龄相关的迟发性聋。同时有流行病学研究发现GJB2基因突变可能与噪声性听力损失(Noise-induced hearing loss,NIHL)有关[36,37]。为了进一步探讨Cx26（GJB2）与NIHL的关系，Zhou等学者[38]在生后第18天(P18)建立了Cx26基因敲除小鼠模型，观察噪声暴露前后小鼠的听阈和形态学变化，发现噪声组小鼠的OHC损失是主要的病理改变，其毛细胞与支持细胞大量丢失，Cx26缺乏导致间隙连接功能障碍并阻碍活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的传播，导致过度堆积，已有研究发现ROS的产生可能是NIHL的一个潜在原因[39]，于是该团队分析提出噪声暴露和Cx26缺失联合作用引起ROS过度生成，氧化应激增加，出现细胞死亡而导致迟发性噪音性听力损失。2019年Lin X团队[40]的研究也发现，有p.V37I突变的小鼠在6个月大时出现听力损失，在其内耳仅发现Cx26半通道形态发生微小改变，该通道保持完整，但缝隙连接之间的距离与对照组相比有变短，这些病理改变没有破坏小鼠耳蜗功能，但使小鼠极易受噪音等环境因素的影响，产生氧化应激，加速迟发性聋的进展。

2.3 自噬在GJB2基因突变的迟发性聋中的作用

自“自噬”这一细胞保护机制被提出以来，许多学者在感音神经性聋如药物性聋、噪声性聋、年龄相关性聋等的研究中也发现，自噬与氧化应激机制一道参与促进内耳毛细胞的正常功能维持[41,42]。细胞自噬通过降解已经氧化的蛋白质和活性氧，从而降低、中和氧化应激水平，减缓听力损失，因此是一种自我保护方式。还有小鼠研究发现，Cx26部分缺乏加强氧化应激，无法减缓毛细胞死亡和听力丧失，提示自噬可能也参与介导GJB2突变相关的迟发性聋[43]。但细胞自噬的分子、信号机制及在GJB2突变相关迟发性聋模型中如何精准逆转氧化应激/自噬水平仍有待进一步探索。

3 GJB2基因致迟发性聋的听力变化

GJB2基因突变导致的迟发性聋听力受损的表型多样，呈轻度至极重度不等[44]。日本Minami等人[6]研究发现14例迟发性聋患者听力损失为中度至极重度；Pagarkar W等人[18]报道2例c.35 delG纯合突变的迟发性聋患者均为重度听力损失；Chai Y等[16]发现6例携带p.V371纯合子突变的迟发性聋患者中，4例为轻或中度听力损失，2例为重度听力损失。可见，GJB2基因突变导致的迟发性聋的听力损失程度不一，这可能与迟发性聋初次诊断的时间有关[45]。

4 GJB2基因相关的迟发性聋的动物模型

动物模型是基础生物学和人类疾病机理研究的基本工具，也是疾病防治研究和治疗手段开发必经之路的基石[46]，因此为了进一步探讨GJB2基因突变相关的迟发性聋的致病机制，建立相关的动物模型是有必要的（如表2）。目前所用的实验动物主要以小鼠为主。Lin X团队[23]为了研究Cx26突变的致聋机制在2009年通过三种不同启动子建立了不同的小鼠模型（Pax2、Foxg1、Rosa26），其中Rosa26小鼠模型在P19注射4-羟基他莫昔芬去除Cx26基因继而建立一种时间依赖性条件性基因敲除小鼠模型。2014年该团队[47]将Cx26loxp/loxp小鼠与Rosa26Cre/Esr1小鼠杂交获得Cx26条件敲除小鼠，分别在出生后第1、6、12天对小鼠注射他莫昔芬（Tamoxifen,TMX），激活 Cre重组酶，去除Cx26基因，观察迟发性聋小鼠的病理改变。2015年Zhu Y团队[31]对杂交获得的CKO小鼠在P10注射TMX敲除Cx26的表达研究迟发性聋的发病机制。因此，通过控制Cx26loxP/loxP;Rosa26CreER小鼠耳蜗中Cx26基因的敲除时机及程度，可以建立不同时间点不同程度Cx26基因敲除的迟发性耳聋模型。2018年Fetoni AR等人[35]用Gjb2loxP/loxP小鼠与Tg(Sox10-cre)1Wdr小鼠回交10代获得C57bl/6n小鼠，再用PCR技术进行基因分型识别，获得Gjb2+/-小鼠模型与Gjb2-/-小鼠模型，由于Gjb2-/-小鼠有先天性听觉障碍，所以使用Gjb2+/-小鼠模型，敲入c.35 delG杂合子突变，建成了c.35 delG杂合子携带者的模型，随着时间的推移，发现该小鼠的ABR和DPOAE逐渐恶化，出现类似于迟发性聋的临床表现。2019年Lin X团队[40]用胚胎干细胞基因靶向法建立了纯合子p.V37I敲入小鼠模型，敲入小鼠表现出与p.V37I突变类似的疾病进展模式，并观察到晚期进行性听力损失,这有助于进一步探索p.V37I突变对迟发性聋的致病机制。

表2 GJB2基因突变相关的迟发性聋的动物模型Table 2 Mouse Models of Late-onset Hearing Loss with GJB2 Mutation

5 治疗与干预

当新生儿基因检测发现有GJB2基因突变时，无论出生时听力筛查是否通过，均建议3月龄时进行听力诊断[48]，并定期随访，了解听力变化情况，以便早期发现，早期治疗。目前GJB2基因突变所致听力损失的治疗方法主要包括佩戴助听器、中耳植入及人工耳蜗植入等。当患者出现中轻度听力损失时可考虑佩戴助听器进行听力补偿，若患者不能佩戴助听器或助听器效果欠佳，或有人工耳蜗植入禁忌症的患者可考虑主动中耳植入（Active middle ear implants,AMEI），Brkic FF 等[49]对 103 例植入振动声桥（Vibrant Soundbridge,VSB）的患者进行了约7.9年的长期随访，发现所有患者听力改善明显，效果满意。当患者听力损失为重度或极重度时，排除手术禁忌症后，可考虑行人工耳蜗植入[50]。Kim SH[51]等对携带GJB2基因突变的耳聋患者人工耳蜗植入后的疗效进行随访，发现患者术后言语及听力康复训练表现良好，GJB2基因突变与否不会影响植入后患者的语音识别。

但以上治疗方法在频率敏感性、言语分辨及噪声环境下仍存在许多缺陷。因此，内耳的基因治疗有可能成为新的遗传性耳聋的治疗方法。Lin X团队[52]将改良的腺相关病毒载体接种到出生后早期条件性Gjb2基因敲除小鼠的耳蜗培养组织中，发现在耳蜗培养的细胞中有大量病毒表达的Cx26，并在突变小鼠耳蜗的Corti器官中重新建立了细胞间隙连接网络，提示这可能是挽救Gjb2突变缺乏小鼠听力功能的一种方法，也是未来人类治疗干预的发展方向。

6 总结与展望

综上所述，GJB2突变可导致迟发性聋，突变种类多样且具有一定的种族地区的差异性。GJB2突变相关的迟发性聋的发生发展机制可能与耳蜗主动放大功能受损、氧化应激及自噬水平有关。随着分子生物学技术不断发展，GJB2基因的功能、特性及其与迟发性非综合征性聋的关系与潜在致病机制将进一步明确，为GJB2突变相关迟发性聋患者的防治开辟新的途径。