FXYD6 过表达对肝细胞癌SMMC7721 细胞5-Fu化疗敏感性的影响

陈雄飞，丁立爽，孔德帅，赵秀雷，廖丽丽，张耀敏，李凤山，刘汝海

沧州市中心医院，河北沧州061001

肝细胞癌是起源于肝细胞的恶性肿瘤，我国肝细胞癌患者多存在乙型病毒型肝炎病史，患者就诊时多属中晚期，根治性切除手术成功率低，术后复发率高［1-2］。肝细胞癌通常为富血供肿瘤，肿瘤供血动脉主要是肝动脉，经肝动脉化疗栓塞（TACE）是肝细胞癌术后重要的辅助治疗手段［3］，也是中晚期肝细胞癌患者的重要治疗方法［4］。5-氟尿嘧啶（5-Fu）是细胞周期特异性药物，在细胞内转化为有效的5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸后，通过阻断胸腺嘧啶核苷酸合成酶而干扰DNA 的合成，主要应用于消化道肿瘤和实体肿瘤的化疗。肝细胞癌细胞的异质性及耐药性可导致其对5-Fu 的敏感性降低，这与肝细胞癌差异表达耐药相关蛋白有关。离子通道相关蛋白在肿瘤进展的分子网络调控中具有重要作用，与肿瘤细胞对化疗药物的耐药性相关。FXYD 离子转运调节因子6（FXYD6）是钠钾泵的重要调节亚基，也是肿瘤相关蛋白，在多种恶性肿瘤中呈高表达［5-8］。前期研究发现，FXYD6 蛋白在肝细胞癌组织中呈高表达，在体外可通过上调钠钾泵的α1亚基，激活其下游Src-ERK 信号传导通路，从而促进肝细胞癌细胞的增殖与转移［6］。目前，FXYD6 蛋白在肝细胞癌细胞中的表达变化及其对细胞化疗敏感性的影响鲜见报道。为此，我们于 2019 年 4 月—2020 年 3 月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：肝细胞癌细胞系HepG2、SNU449、Huh-7、SMMC7721 及人正常肝细胞 HL-7702（L-02）均购自美国 ATCC 细胞库。质粒：对照空载体真核表达质粒pcDNATM3.1/Vector 购自日本TaKaRa 公司，真核表达质粒pcDNATM3.1/FXYD6 为前期制备［9］。主要试剂：LipofectamineTM2000 转染试剂购自美国Invitrogen 公司，胰蛋白酶、青—链霉素混合液购自美国Gibco 公司，鼠抗hFXYD6 单克隆抗体为前期制备［10］；Western blot Kit高灵敏度化学发光检测试剂盒购自北京康为世纪生物有限公司，HRP 标记的山羊抗小鼠IgG 购自北京索莱宝科技有限公司，MTT 检测试剂盒、GAPDH 单克隆抗体、Caspase-3 单克隆抗体均购自英国Abcam公司，Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 肝细胞癌细胞的筛选 采用Western blotting法 。 取 对 数 生 长 期 的 HepG2、SNU449、Huh-7、SMMC7721及对照L-02细胞，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白。进行SDS-PAGE 电泳，15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上；分别加入FXYD6、GAPDH 一抗（稀释比例分别为1∶1 000、1∶2 000），室温孵育1 h，PBST清洗3次；加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵化45 min，PBST 清洗 3 次。以 GAPDH 为内参，采用 Western blot Kit 高灵敏度化学发光检测试剂盒检测目的蛋白条带。结果显示，FXYD6蛋白在HepG2、SNU449、Huh-7 细胞中高表达，而在SMMC7721 细胞和对照L-02 细胞中低表达或不表达，见图1。因SMCC7721低表达FXYD6 蛋白，故选取SMMC7721 细胞进行后续实验。

图1 FXYD6蛋白在肝细胞癌细胞系及对照L-02细胞中的表达条带图（Western blotting法）

1.3 细胞分组与转染处理 将肝细胞癌SMMC7721细胞在RPMI 1640 培养液中常规培养，待培养至对数生长期，用0.25%胰蛋白酶消化，以3×105/孔接种于4 孔板中，加入完全培养液。待细胞融合度达80%，随机分为过表达组和对照组。过表达组和对照组分别加入100 µL 无血清RPMI 1640 培养液稀释的 pcDNA3.1/FXYD6、pcDNA3.1/Vector 真核质粒（各2 µg），加入转染试剂LipofectamineTM2000 溶液10 µL，轻轻混匀。室温孵育30 min，用无血清RPMI 1640 培养液洗涤细胞，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液。培养48 h 后加入2 mg/mL 含G418 的完全培养液筛选阳性克隆，待克隆形成后，分别挑选质粒转染后的SMMC7721 抗性克隆，并扩大培养。

1.4 细胞增殖能力观察 采用MTT 法。取两组转染后的抗性克隆细胞，胰酶消化后，以5×103/孔接种于 96 孔板中，分别加入终浓度为 0、12.5、25、50、100 µg/mL 的5-Fu 100 µL，在37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养24、36、48 h。每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 µL，继续培养4 h；弃孔内液体，加入150 µL二甲基亚砜，脱色摇床振荡10 min，使结晶物充分溶解，在 2500 型 BIO-RAD 酶标仪上检测 490 nm 处的光密度（OD）值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验孔OD 值）/对照孔OD 值×100%。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.5 细胞凋亡能力观察 采用流式细胞术。取两组转染后的细胞，胰酶消化后，以5×103/孔接种于6孔板中，继续培养24 h，并加入终浓度为25µg/L 的5-Fu作用48 h。干预结束后，用70%乙醇固定细胞，并根据试剂盒说明书操作步骤进行Annexin V 及PI染色。避光孵育15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.6 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以±s表示，两组间比较和组内比较分别采用成组t检验和配对t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组经不同浓度5-Fu作用后的细胞增殖抑制率比较 随着5-Fu浓度增加和作用时间延长，两组细胞增殖抑制率均呈升高趋势。5-Fu浓度为12.5µg/mL时，两组作用24、36、48 h的细胞增殖抑制率比较均无明显差异（P均＞0.05）；5-Fu浓度为25、50、100µg/mL时，过表达组作用24、36、48 h 的细胞增殖抑制率均明显低于对照组同时间点（P均＜0.01）。见表1。

表1 两组经不同浓度5-Fu作用后的细胞增殖抑制率比较（-x± s）

2.2 两组细胞凋亡率比较 观察组细胞凋亡率为35.62% ± 3.98%，对照组为46.19% ± 6.60%，两组比较P＜0.01。

3 讨论

乙型肝炎病毒感染是导致肝细胞癌变最主要的原因，绝大部分患者感染乙型肝炎病毒后，肝内纤维结缔组织异常增生长导致肝硬化的发生，最终发展为肝细胞癌［11-12］。肝细胞癌起病隐匿，早期就诊率低，根治性切除率低，根治性切除术后5年复发率高达70%［13］。目前化疗是肝细胞癌治疗的一个辅助手段，5-Fu 是局部或全身化疗过程中常用的化疗药物，可通过阻断胸腺嘧啶合成，诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。研究显示，以5-Fu 为基础的化疗方案在晚期肝细胞癌患者的肿瘤反应和生存方面显示出一定优势［14］。但很多肝细胞癌患者对5-Fu 天然耐药或在治疗过程中产生耐药，导致5-Fu 化疗效果降低，引起肝细胞癌复发和转移，是化疗失败的主要原因，这与肝细胞癌药物治疗靶点缺乏和抗癌药耐药性增加有关［15］。因此，寻找与肝细胞癌化疗耐药相关的蛋白，将为改善肝细胞癌患者预后提供新思路。

膜转运蛋白参与维持细胞稳态及临床药物耐药性等细胞功能，已成为癌症治疗的新靶标［16］。钠钾泵是由不同的α 和β 亚基组成的同工酶，在维持细胞稳定性方面具有重要作用，其在细胞黏附中发挥关键作用，并与多种癌症的发生和发展相关，是抗癌治疗的重要靶标［17］。钠—钾泵抑制剂可提高传统放、化疗不敏感肿瘤的放化疗敏感性［18］。FXYD6 蛋白为离子通道相关蛋白，是钠—钾泵的调节亚基，在维持细胞钠、钾离子跨膜浓度梯度方面具有重要作用。FXYD6 蛋白也是肿瘤相关蛋白，目前尚无研究表明FXYD6 差异表达与肝细胞癌耐药相关。本研究结果显示，FXYD6 蛋白在肝细胞癌HepG2、SNU449、Huh-7 细胞中高表达，而在肝细胞癌SMMC7721 细胞和对照L-02 细胞中低表达或不表达；提示FXYD6蛋白在不同的肝细胞癌细胞中存在差异表达，并选择FXYD6 低表达的SMMC7721 细胞进行后续实验。本研究结果显示，随着药物浓度增加和作用时间延长，两组细胞增殖抑制率均呈升高趋势；5-Fu 浓度为12.5 µg/mL 时，两组作用24、36、48 h 的细胞增殖抑制率比较均无明显差异；5-Fu 浓度为 25、50、100 µg/mL 时，过表达组作用 24、36、48 h 的细胞增殖抑制率均明显低于对照组同时间点。因临床工作中化疗患者5-Fu 基本上是作用48 h，而 12.5 µg/L 5-Fu 作用后两组细胞增殖抑制率没有统计学差异，因此选择25µg/L 5-Fu作用48 h进行细胞凋亡实验；结果显示，观察组细胞凋亡率明显低于对照组。以上均说明，FXYD6可降低5-Fu对肝细胞癌SMMC7721细胞的化疗敏感性。既往研究显示，5-Fu 的癌细胞耐药机制包括细胞内药物富集减少、凋亡相关蛋白异常表达，细胞凋亡减少、DNA损伤修复和细胞周期相关蛋白表达异常等［19］。本研究FXYD6 蛋白表达升高促进了SMMC7721 细胞对5-Fu 的化疗耐药性，其机制可能与通过影响钠—钾泵活性而减少细胞凋亡有关，仍需进一步证实。

综上所述，FXYD6 蛋白过表达可降低肝细胞癌SMMC7721 细胞对5-Fu 的化疗敏感性。靶向调控FXYD6 蛋白表达有望成为提高肝细胞癌患者化疗敏感性的有效手段，但是其在体内对肝细胞癌细胞化疗敏感性的作用机制仍需进一步验证。