基于网络药理学方法对芪归八味汤治疗病毒性心肌炎作用机制的分析

高敏，职利琴 ，吴倩，郭洪兆

1 陕西中医药大学，陕西咸阳712046；2 西安市第五医院

病毒性心肌炎（VMC）是指感染病毒之后引起的，以心肌非特异性炎症为主要病变的心血管系统疾病，好发于年轻人群，被认为是青少年群体发生心力衰竭、心律失常和猝死的一个重要原因［1］。目前，临床上针对VMC 的治疗以抗病毒治疗和营养心肌为主，但疗效并不乐观。单纯的西医治疗容易使病毒产生耐药性，有研究在西医基础上联合使用中药治疗VMC，结果显示可有效改善患者症状，提高其免疫力、降低复发风险［2-3］。芪归八味汤以当归补血汤和生脉散为基础方，主要由黄芪、当归、太子参、麦冬、五味子、柏子仁、天冬、红花八味药组成，主治气阴两虚型VMC。网络药理学是由英国药理学家HOPKINS［4］首次提出的，主要是以系统生物学和生物信息学为基础，全面分析药物与疾病和靶点之间的“多成分、多靶点、多途径”协同作用关系。2019年10 月—2020 年9 月，本研究采用网络药理学方法分析芪归八味汤治疗VMC的作用机制。现报告如下。

1 方法

1.1 药物活性成分筛选与靶点预测 在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp. php）数据库中，根据ADME 参数设置口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 为筛选条件，收集芪归八味汤中各中药的化学成分及其作用靶点。因TCMSP 数据库中未收录麦冬，在中药分子机制的生物信息学分析工具（BATMAN-TCM）数据库中获得麦冬的化学成分，设置“药物—靶点”模型的相似性阈值≥20、P≤0.05，选取符合条件的活性成分。选择UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）的UniProtKB 搜索功能，将靶蛋白转换为对应的靶基因，得到所有靶基因的官方名称。将得到的靶点信息进行统计整理，利用Cytoscape3.7.2 软件以8 味中药筛选后的化学成分与标准化的基因名称为基础，根据Degree 值大小依次排列，绘制药物—成分—靶点关系网络图。

1.2 药物—疾病共同靶点获取 在OMIM 数据库（http：//omim. org/）和 Genecards 数据库，以“Viral myocarditis”为检索词，收集VMC 的疾病相关靶点。将去重后的疾病靶点与药物靶点通过R软件绘制韦恩图，获得药物—疾病共同靶点。

1.3 蛋白相互作用（PPI）网络构建及核心靶点筛选 将关键靶点输入String 数据库（https：//stringdb. org/），研究物种设置为Homo sapiens，置信度设置为0.9，隐藏游离的节点，获得可视化关于药物—疾病共同靶点的PPI 网络图，并导出TSV 文件。将PPI 网络图导入 Cytoscape3.7.2，通过 Network Ana⁃lyzer 进行分析，将平均 Degree 值为 8.870 4、平均紧密度为0.427 0、平均介度为0.014 9作为标准，三项均高于上述标准的靶点即为芪归八味汤治疗VMC的核心靶点。

1.4 核心靶点的基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将芪归八味汤治疗VMC 的核心靶点进行GO 功能和KEGG通路分析，设置P＜0.01。按照每个条目涉及的靶点数目进行排序，根据P值大小列出前20 条路径，筛选排名靠前的生物过程和通路。

2 结果

2.1 活性成分筛选结果 TCMSP 数据库对芪归八味汤中7 味中药的活性成分进行检索，结果显示共收集 616 种成分（黄芪 87 种、当归125 种、太子参 25种、五味子130种、天冬32种、柏子仁28种、红花189种），筛选并删除无靶点的成分后得到42 种有效成分（黄芪16种、当归2种、太子参5种、五味子7种、天冬 7 种、柏子仁 5 种、红花 16 种）；BATMAN-TCM 数据库检索结果显示麦冬的有效成分共18种。其中，太子参、红花、天冬和当归的重复成分为β-谷甾醇，太子参和红花的重复成分为木犀草素，红花和黄芪的重复成分为山柰酚，红花、黄芪和天冬的重复成分为槲皮素，红花、当归、天冬和麦冬的重复成分为豆甾醇。8 味中药共对应有效基因靶点1 252 个，剔除重复靶点后最终获得479个药物靶点。

2.2 药物—成分—靶点关系网络图绘制结果 药物—成分—靶点关系网络图包括552个节点（药物8个、成分 66 个、靶点479 个）和1 706 条边。成分按Degree 值大小排名前10 位分别为槲皮素（448）、豆甾醇（210）、β-谷甾醇（140）、山柰酚（115）、木犀草素（112）、尿苷（44）、花生四烯酸（38）、7-O-methyliso⁃mucronulatol（38）、pseudoprotodioscin_qt（38）、鸟 嘌呤核苷（38），靶点按Degree 值大小排名前10 位分别为 PTGS2（41）、NCOA2（37）、PTGS1（31）、PRSS1（22）、PGR（20）、AR（20）、GABRA1（20）、DPP4（18）、SCN5A（17）、ADRB2（17）。

2.3 药物—疾病共同靶点获取 将OMIM 和Gene⁃cards 数据库的VMC 相关靶点汇总，删除重复靶点后得到1 058个疾病靶点，与479个药物靶点取交集，得到124个药物—疾病共同靶点。

2.4 PPI 网络图构建及核心靶点筛选结果 PPI 网络图包括124 个节点、479 条边，筛选出的核心靶点有19 个，分别为肿瘤坏死因子（TNF）、JUN、RELA、AKT1、MAPK1/8/14、白细胞介素（IL）-4/6、TP53、CXCL8、EGFR、FOS、VEGFA、CASP8、EGF、CTNNB1和EDN1。见表1。

表1 芪归八味汤治疗VMC的核心靶点信息

2.5 核心靶点的GO 功能富集分析结果 GO 功能富集分析得到2 739 个条目，在生物学过程（BP）中富集2 502 条路径，主要参与对细菌来源分子的反应、对脂多糖的反应、对氧化应激的反应、外源性凋亡信号通路等过程；在细胞成分（CC）中富集92条路径，主要涉及薄膜筏、膜微域、膜区域等部位；在分子功能（MF）中富集145 条路径，主要涉及受体配体活动、细胞因子受体结合等方面。

2.6 核心靶点的KEGG通路富集分析结果 KEGG通路富集分析得到164 条通路途经，富集排名靠前的通路主要有糖尿病并发症中的AGE/RAGE 信号通路（靶点数目32）、TNF 信号通路（靶点数目29）、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路（靶点数目30）、乙型肝炎（靶点数目31）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路（靶点数目32）、南美锥虫病（靶点数目26）、IL-17 信号通路（靶点数目27）、人巨细胞病毒感染（靶点数目30）、MAPK信号通路（靶点数目30）、丙型肝炎（靶点数目26）、甲型流感（靶点数目26）、人类免疫缺陷病毒1 感染（靶点数目25）、细胞凋亡（靶点数目24）等。

3 讨论

VMC 根据临床症状划属于“温病”“心悸”“胸痹”“怔忡”等范畴。因患者体质虚弱，又复感温热病邪，温毒之邪犯及心脉发为本病。该病病位在心，涉及脾、肺、肾等脏器，属本虚标实之证［5］。目前临床药物治疗策略大多是抗氧化、营养心肌、抗病毒等，但效果并不理想。芪归八味汤是笔者导师多年的临床经验总结，由当归补血汤和生脉散为基础方加减，主治气阴两虚型VMC，共八味药。黄芪、当归补气养血，太子参、麦冬和五味子滋阴止汗、益气复脉，柏子仁和天冬滋心阴、安心神，红花调和诸药、通畅血运。研究表明，黄芪皂苷可以显著抑制炎症因子IL-1β、TNF-α 等表达，太子参多糖可抑制心肌细胞凋亡，麦冬改善心肌缺血，五味子能减少炎症反应对心肌的损害，红花强心，天冬降压、减慢心率，柏子仁营养心肌［6］。因此，芪归八味汤全方八味中药对心血管系统有不同的保护作用。

本研究通过对药物—成分—靶点网络图分析可知，芪归八味汤主要的化学成分是槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素等。研究表明，槲皮素具有抗病毒、抗炎、清除活性氧自由基等作用，可通过降低 VMC 小鼠 TGF-β1和 TNF-α 表达抑制 NF-κB通路的激活［7-9］。豆甾醇可显著抑制 TNF-α、IL-6 和IL-1β 表达，并通过下调NF-κB p65 和p38 MAPK，增加 IL-10 释放［10］。JINA 等［11］研究发现，β-谷甾醇具有抗炎作用，可减少IL-1、TNF-α 等炎症因子释放。木犀草素可以减轻炎症反应，并通过调节NF-κB 和MAPK 信号通路来缓解氧化应激［12］。由此可见，芪归八味汤的化学成分主要通过抗炎以及降低氧化应激来治疗VMC。

本研究PPI 结果显示，芪归八味汤作用于VMC的 核 心 靶 点 主 要 是 TNF、JUN、RELA、AKT1、MAPK1/8/14、IL-4/6、TP53、CXCL8、EGFR、FOS、VEGFA、CASP8、EGF、CTNNB1 和 EDN1。TNF 是一类促炎因子，而VMC 的心肌病变可能与TNF-α 有关，高水平的TNF-α 会对心肌造成损伤；此外，TNF-α 还可以激活NF-κB 信号通路，进而促进炎症因子分泌［13］。JUN 主要参与细胞增殖、免疫相关以及凋亡抑制等信号通路［14］。AKT 是 PI3K/AKT 信号通路中的核心桥梁点，参与炎症过程、心血管疾病等的发生发展［15-16］；此外，AKT 可以促进 CASP 磷酸化，进而抑制细胞凋亡［17］。巩子汉等［18］发现，MAPK1 不仅可以正向调控TNF-α 表达，还可以和MAPK14 共同参与炎症反应过程。由此可见，芪归八味汤可通过多个靶点治疗VMC。

本研究KEGG 富集分析结果显示，排名靠前的通路有糖尿病并发症中的AGE/RAGE 信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、乙型肝炎、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、人巨细胞病毒感染、MAPK 信号通路、TNF 通路、细胞凋亡、IL-17 信号通路等。TNF通路主要促进TNF-α、IL-6、IL-8 等炎症因子释放，加重机体的炎症反应［19］。IL-17信号通路是一条经典的促炎通路，参与机体炎症反应过程［20］。MAPK 信号通路涉及细胞生长、增殖和凋亡等功能［21］。杨超茅等［22］发现，AGE/RAGE 信号通路可以激活NADPH 氧化酶，继而活化NF-κB，从而释放大量 TNF-α、IL-1 等炎症因子。TNF 通路和IL-17信号通路与炎症反应密切相关，提示芪归八味汤可能主要作用于炎症因子来抑制炎症反应，从而发挥治疗VMC的作用。

综上所述，本研究基于网络药理学的方法系统研究了芪归八味汤治疗VMC 的作用机制，表明芪归八味汤中的活性成分可通过调节AGE/RAGE、MAPK、TNF、IL-17信号通路等，减轻炎症反应、抑制细胞凋亡，发挥治疗VMC 的作用，证实了中药复方多靶点、多途径、协调治疗疾病的过程。