HIF-1α基因沉默对缺氧诱导晶状体上皮细胞转分化的影响

孙乙，王惠，于腾飞，朱艳，朱玉广

1 潍坊医学院，山东潍坊261053；2 潍坊医学院附属医院

后囊膜混浊（PCO）是白内障术后最常见的并发症，严重影响了患者的视觉质量，目前尚无有效的治疗药物［1-3］。研究发现，PCO 主要是由于白内障术后残留的晶状体上皮细胞（HLECs）发生过度增殖、移行并分化而导致的［4］。在正常情况下HLECs位于富氧的晶状体前部，而白内障手术后HLECs 移动到晶状体后部的缺氧微环境中，并开始增殖、转分化过程［5］。E-cadherin 和 α-SMA 是上皮细胞间质转化的标志性蛋白，通过检测E-cadherin 和α-SMA 表达可以评估上皮细胞间质转化的程度［6］。研究证实，在缺氧微环境下，缺氧诱导因子1α（HIF-1α）发挥着重要作用，并参与启动 HLECs 的转分化［7］。2019 年8 月—2020 年 4 月，本研究观察了 HIF-1α 基因沉默对缺氧诱导HLECs 转分化的影响，为明确PCO 发生的分子生物学机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：HLEC-B3 细胞株购于上海复蒙公司。主要试剂：DMEM 培养液、TRIzol 试剂（美国Gibco 公司），胎牛血清（澳大利亚Hyclone 公司），Power SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒（美国ABI公司），逆转录试剂盒、Real-time RNA 提取试剂盒（上海生工生物工程有限公司），兔抗人HIF-1α、E-cadherin 单克隆抗体（美国Santa Cruz 公司），兔抗人α-SMA 单克隆抗体（美国CST 公司），FITC 标记羊抗兔二抗、山羊抗兔IgG（上海生工生物工程有限公司），siRNA Control、HIF-1α siRNA 质粒（上海吉玛制药技术有限公司），LipofectamineTM2000 转染试剂（美国Invitrogen 公司）。质粒：HIF-1α siRNA 委托上海吉玛制药技术有限公司设计合成，HIF-1α siRNA的有效序列为5′-GUGAUGAAAUUCCGAAUTT-3′，并经过mRNA 有效性检测，阴性siRNA 不会引起基因序列变化。

1.2 HLEC-B3 培养及传代 快速解冻液氮保存的HLEC-B3，加入含10%胎牛血清的DMEM 培养液，吹打混匀后培养。3～4 d 更换1 次DMEM 培养液。待HLEC-B3 融合度达90%时，胰酶消化传代。选择传至3代的HLEC-B3进行实验。

1.3 细胞分组与处理 取处于对数生长期的HLEC-B3，随机分为常氧对照组、缺氧对照组、阴性siRNA缺氧组和HIF-1α siRNA缺氧组，胰酶消化，培养24 h后去培养液。缺氧对照组、阴性siRNA缺氧组和HIF-1α siRNA缺氧组加入终浓度为100µmol/L的CoCl2溶液，37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱内进行缺氧培养24 h。阴性siRNA缺氧组和HIF-1α siRNA缺氧组缺氧处理24 h，采用脂质体LipofectamineTM2000转染试剂转染阴性siRNA 和HIF-1α siRNA，转染24 h后进行后续检测。

1.4 细胞HIF-1α、E-cadherin 及α-SMA mRNA 表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。取各组细胞，采用TRIzol 试剂提取总RNA，逆转录为cDNA，以cDNA 为模板进行PCR 反应。PCR 引物序列由上海生工生物工程有限公司设计合成，见表1。PCR 反应条件：95 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，58 ℃退火30 s，74 ℃延伸30 s，共39 个循环；最后58 ℃作用30 s。采用 2－ΔΔCt法计算各组细胞 HIF-1α、E-cadherin 及 α-SMA mRNA相对表达量。

表1 HIF-1α、E-cadherin、α-SMA及内参GAPDH引物序列、引物长度

1.5 细胞HIF-1α、E-cadherin及α-SMA蛋白表达 采用Western blotting 法。取各组细胞，胰酶消化，加入RIPA 裂解液充分裂解，蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA protein assay reagent 检测蛋白浓度。按体积比为4∶1 加入上样缓冲液，水浴变性，进行SDSPAGE电泳。采用湿转法蛋白转PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，分别加入兔抗人HIF-1α、E-cadherin及α-SMA单克隆抗体（稀释比例分别为1∶600、1∶800、1∶500），4 ℃孵育过夜。洗膜后加入二抗，室温孵育2 h。再次PBS-T 洗膜，取 ECL 试剂盒中 A 液 0.5 mL、B 液 0.5 mL，加入PVDF 膜，避光反应15 min，曝光扫描。采用Image-Pro Plus 图像软件分析条带灰度值，以β-actin 为内参，计算HIF-1α、E-cadherin 及α-SMA 蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件。计量资料以-x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞HIF-1α、E-cadherin 及α-SMA mRNA表达比较 与常氧对照组比较，缺氧对照组、阴性siRNA 缺氧组HIF-1α mRNA 相对表达量均升高，HIF-1α siRNA缺氧组HIF-1α mRNA相对表达量降低（P均＜0.05）。与常氧对照组比较，缺氧对照组、阴性siRNA 缺氧组E-cadherin mRNA 相对表达量均降低、α-SMA mRNA相对表达量均升高（P均＜0.05）。与缺氧对照组、阴性siRNA缺氧组比较，HIF-1α siRNA缺氧组E-cadherin mRNA 相对表达量升高、α-SMA mRNA相对表达量降低（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞HIF-1α、E-cadherin及α-SMA mRNA表达比较（-x± s）

2.2 各组细胞HIF-1α、E-cadherin 及α-SMA 蛋白表达比较 与常氧对照组比较，缺氧对照组、阴性siR⁃NA 缺氧组 HIF-1α 蛋白相对表达量均升高，HIF-1α siRNA 缺氧组 HIF-1α 蛋白相对表达量降低（P均＜0.05）。与常氧对照组比较，缺氧对照组、阴性siRNA 缺氧组E-cadherin 蛋白相对表达量均降低、α-SMA 蛋白相对表达量均升高（P均＜0.05）。与缺氧对照组、阴性siRNA 缺氧组比较，HIF-1α siRNA缺氧组E-cadherin 蛋白相对表达量升高、α-SMA 蛋白相对表达量降低（P均＜0.05）。见表3、图1。

表3 各组细胞HIF-1α、E-cadherin及α-SMA蛋白表达比较（-x± s）

3 讨论

图1 各组细胞HIF-1α、α-SMA、E-cadherin蛋白表达条带图（Western blotting法）

白内障目前是我国发病率最高的致盲性眼病，主要治疗方法是白内障超声乳化联合人工晶体植入术，而对于屈光性白内障手术来说，PCO是高端人工晶体植入术后视觉干扰的主要原因之一［8-11］。在生理状态下，与眼睛中的其他组织相比，晶状体缺乏有氧呼吸［7］。晶状体前部主要从房水中吸收氧气，而晶状体后部的氧气由玻璃体供应［12］。房水中的氧张力比玻璃体中的氧张力高很多，因此晶状体前部处于富氧环境，后部则处于缺氧环境［13-14］。在正常情况下HLECs 位于富氧的晶状体前部，而白内障术后晶状体囊袋内残留的富氧环境中的HLECs 移动到晶状体后部缺氧微环境中，在缺氧、炎症因子等刺激下，HLECs 在数小时内开始增殖、迁移和转分化过程［4，11］。因此，抑制 HLECs 增殖、迁移、转分化是一种预防PCO 的有效方法。本研究对HLECs 进行100 µmol/L CoCl2处理，建立HLECs 缺氧模型，以模拟体内HLECs的缺氧微环境［5，15］。

在缺氧微环境中，术后残存的HLECs 通过多种方式适应缺氧微环境，其中缺氧诱导因子1（HIF-1）发挥着中心介导作用［5，7］。HIF-1 蛋白由 α 和 β 两个亚单位组成，其中HIF-1α 亚单位被认为是特异性氧调节亚单位，决定了HIF-l 的活性。研究发现，活化的HIF-l 可与靶基因上的HIF-l 结合位点结合，形成转录起始复合物，从而启动靶基因转录，使机体适应缺氧环境［16］。因此，本研究以HIF-1α 为靶点进行了HIF-1α 基因沉默实验。本研究结果显示，与常氧对照组比较，缺氧对照组、阴性siRNA 缺氧组HIF-1α mRNA 及蛋白相对表达量均升高，证实缺氧可以诱导 HLECs 的 HIF-1α 表达增加，而 HIF-1α siRNA 缺氧组HIF-1α mRNA 及蛋白相对表达量均低于其他各组，证实成功沉默HIF-1α基因表达。

HLECs 转分化是指上皮细胞的极性改变，失去已分化的上皮细胞表型，出现肌成纤维细胞的表型改变，使HLECs 获得迁移、浸润能力。转分化的特征性改变是介导细胞黏附属性的黏附因子E-cadherin 表达下调或消失，代表肌成纤维细胞的α-SMA 表达增加。白内障术后残存的HLECs 转分化，形成大量细胞外基质，包括纤维蛋白、糖蛋白及各种胶原蛋白纤维沉积于后囊膜上，使后囊膜皱缩，导致PCO 的形成，最终影响患者的视功能［17］。本研究结果显示，与常氧对照组比较，缺氧对照组、阴性siRNA 缺氧组E-cadherin mRNA 及蛋白相对表达量均降低、α-SMA mRNA及蛋白相对表达量均升高，说明缺氧环境会诱导HLECs 转分化；与缺氧对照组、阴 性 siRNA 缺 氧 组 比 较 ，HIF-1α siRNA 缺 氧 组E-cadherin mRNA 相对表达量升高、α-SMA mRNA相对表达量降低，说明沉默HIF-1α 基因表达可以抑制缺氧诱导的HLECs转分化，证实HIF-1α参与了缺氧诱导的HLECs 转分化过程，对于减少PCO 的发生具有重要意义。

综上所述，HIF-1α 基因沉默可以抑制缺氧诱导的HLECs 发生转分化，为白内障术后PCO 的防治提供了新靶点，也为临床了解白内障术后PCO 的发生及发展提供了新思路。