滇白珠乙酸乙酯提取物对腹泻小鼠的止泻作用及其胃肠功能调节机制观察

农志欢，何飞 ，苏华，董晓倩

1 广西壮族自治区人民医院，南宁530021；2 广西中医药研究院；3 广西中药质量标准研究重点实验室

腹泻对儿童健康危害极大，是造成小儿营养不良、生长发育障碍及死亡的重要原因之一，也是引起儿童患病和死亡的第二大病因，在许多发展中国家甚至是造成儿童死亡的第一原因［1-3］。滇白珠是杜鹃花科白珠树属植物全株［4］，是一种经典的瑶药。现代药理学研究表明，滇白珠具有抗炎镇痛、抑菌、抗氧化等药理作用［5-6］。前期研究发现，滇白珠提取物能显著减少蓖麻油所致腹泻小鼠的腹泻次数，减轻新斯的明导致的胃排空和小肠推进功能亢进，抑制大鼠离体回肠痉挛性收缩［7］。本课题组前期进一步分离滇白珠提取物，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂进行萃取，并对各个部位进行了药效初步筛选，发现滇白珠的乙酸乙酯部位活性最强。2018 年 12 月—2019 年 4 月，本研究制备了滇白珠的乙酸乙酯提取物，并观察其对腹泻小鼠的止泻作用及胃肠功能调节机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：SPF 级SD 大鼠8 只，体质量200～220 g；昆明小鼠200 只，体质量18～22 g；雌雄参半，均购自广西医科大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK桂2014-0002；动物观察室设置温度24～26 ℃，相对湿度50%～70%，雌雄分饲，适应性喂养1 周。药物与试剂：滇白珠购自广西金秀瑶族自治县，由广西中医药研究院何开家主任（中药师）鉴定为杜鹃花科植物滇白珠的全株。易蒙停（生产批号：180511650）购自西安杨森制药有限公司，甲硫酸新斯的明（生产批号：1208171）购自河南润弘制药股份有限公司，硫酸阿托品（生产批号：93120220）购自成都制药一厂，氯化乙酰胆碱（生产批号：112120103）购自上海源叶生物科技有限公司，蓖麻油（生产批号：20120813）购自广东省化学试剂工程技术研究开发中心，番泻叶（生产批号：18101702）购自国药仁乐堂河北药业有限公司。

1.2 药物制备

1.2.1 滇白珠乙酸乙酯提取物（简称滇白珠提取物）制备 取滇白珠药材1 kg，水煮3 次，每次加10倍量水。第 1 次煮 2 h，第 2、3 次各煮1 h，浓缩水液至密度约为1.10。加95%乙醇至溶液的乙醇含量达70%，静置沉淀，收集上清液。沉淀物用70%乙醇洗涤3次，合并乙醇液，回收溶剂，得到乙醇浸膏。加水溶解，用乙酸乙酯进行萃取，回收溶剂，得到滇白珠提取物，得率约为0.8%。

1.2.2 番泻叶提取物制备 称取300 g 番泻叶药材，加入100 ℃纯净水1.5 L，水浴保温且不断搅拌30 min，双层滤布压榨过滤，获得浓度为20%的番泻叶药汁900 mL，4 ℃冰箱保存。

1.3 滇白珠提取物对腹泻小鼠止泻作用的观察

1.3.1 滇白珠提取物对小肠性腹泻小鼠止泻作用的观察 取昆明小鼠50只，随机分成5部分，每部分10只，分别按照体质量灌胃给予20、10、5 g/kg（按生药计算）的滇白珠提取物及6 mg/kg 易蒙停、等体积溶媒（3.2%吐温-80溶液），1次/d，持续7 d。末次给药1 h 后，所有小鼠灌胃给予蓖麻油10 mL/kg，立即将小鼠单只置于鼠笼中，观察并记录5 h内每间隔1 h小鼠的正常便数、稀便数、稀便级，根据稀便率、稀便级计算腹泻指数（腹泻指数=稀便率×稀便级）。

1.3.2 滇白珠提取物对大肠性腹泻小鼠止泻作用的观察 取昆明小鼠50只，随机分成5部分，每部分10 只。参照 1.3.1 的方法进行分组处理，1 次/d，持续7 d。末次给药1 h 后，所有小鼠灌胃给予番泻叶提取物2.5 g/kg，后续操作及观察指标同1.3.1。

1.4 滇白珠提取物对小鼠胃肠推进运动影响的观察

1.4.1 滇白珠提取物对正常小鼠胃肠推进运动影响的观察 采用炭末推进试验。取昆明小鼠50只，随机分成5 部分，每部分10 只。参照1.3.1 的方法进行分组处理，1 次/d，持续5 d。第4 天给药后小鼠禁食（不禁水）24 h，第5 天末次给药1 h 后，每间隔2 min 对不同组号顺序的小鼠灌胃给予黑色炭末糊0.8 g。20 min 后脱颈处死小鼠，快速剖腹，结扎小鼠胃贲门和幽门，取出胃组织。先称量胃全重，将胃内残留物清理干净，再称量胃净重。计算小鼠胃内残留物的重量（胃内残留物重量=胃全重-胃净重）及胃内残留率［胃内残留率（%）=胃内残留物重量/炭末糊重量×100%］。同时取出小肠，自然平铺在尺子上，测量小肠总长度（胃幽门至回盲部的长度）及炭末糊推进长度（胃幽门至炭末糊推进前沿的长度），计算小肠推进率［小肠推进率（%）=炭末糊推进前沿的长度/小肠总长×100%］。

1.4.2 滇白珠提取物对胃肠功能亢进小鼠胃肠推进运动影响的观察 采用炭末推进试验。取昆明小鼠50只，随机分成5部分，每部分10只。参照1.3.1的方法进行分组处理，1 次/d，持续5 d。第4 天给药后小鼠禁食（不禁水）24 h，第5天末次给药1 h后，每间隔2 min 对不同组号顺序的小鼠皮下注射甲硫酸新斯的明0.15 mg/kg，20 min后每间隔2 min对不同组号顺序的小鼠灌胃给予黑色炭末糊0.8 g，后续操作及观察指标同1.4.1。

1.5 滇白珠提取物对大鼠离体小肠张力影响的观察

1.5.1 离体肠段制备 取SPF 级SD 大鼠8 只，禁食不禁水24 h。脱颈处死，快速剖腹，取一段小肠，置于4 ℃台氏液中，剪成若干约1 cm的肠段备用。

1.5.2 滇白珠提取物对大鼠离体正常小肠张力影响的观察 预先开启ZH-Z离体器官检测系统，使水浴温度保持在37 ℃左右，通入空气，调节好空气流量。取1.5.1制备的1条小肠段，两端对角穿线将其放在盛有20 mL 台氏液的恒温浴管中。连接生物机能实验系统，调节离体小肠段基础张力为0.5 g 左右。待其运动稳定后，往浴槽中分别加入9、4.5、2.25 g/mL 的滇白珠提取物100 µL（终浓度分别为44.78、22.39、11.19 µg/mL）及0.02 mg/mL 硫酸阿托品（终浓度为0.1µg/mL）、溶媒各100µL，分别记录小肠药物作用前的基础张力以及作用2.5、5.0 min的张力。计算作用2.5、5.0 min 的张力抑制率。张力抑制率（%）=（基础张力-作用后张力）/基础张力×100%。实验重复8次，取平均值。

1.5.3 滇白珠提取物对大鼠离体张力亢进小肠张力影响的观察 取1.5.1 制备的1 条小肠段置于浴槽中，待肠段收缩稳定后，加入氯化乙酰胆碱（终浓度15 mg/L），使小肠张力亢进。待小肠运动3.0 min后，往浴槽中分别加入9、4.5、2.25 g/mL 的滇白珠提取 物 200 µL（终 浓 度分 别为 89.11、44.56、22.28 µg/mL）及0.02 mg/mL 硫酸阿托品（终浓度为0.2 µg/mL）、溶媒各200 µL，分别记录小肠药物作用前的基础张力及加入乙酰胆碱平台期、药物作用2.5 min、药物作用5.0 min 的张力。计算给药后2.5、5.0 min 的张力抑制率。张力抑制率（%）=（加入乙酰胆碱平台期张力-作用后张力）/（加入乙酰胆碱平台期张力-基础张力）×100%。实验重复8次，取平均值。

1.6 统计学方法 采用SPSS16.0 统计软件。计量资料以-x±s 表示，方差齐时多组间比较采用单因素方差分析，方差不齐时采用Dunnett′sT3检验，两组间比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同药物作用后小肠性腹泻小鼠稀便率、稀便级及腹泻指数比较 与溶媒作用后比较，20、10 g/kg滇白珠提取物及易蒙停作用后小肠性腹泻小鼠稀便率、稀便级及腹泻指数均降低，5 g/kg滇白珠提取物作用后小肠性腹泻小鼠稀便率、腹泻指数均降低（P均＜0.01）。见表1。

表1 不同药物作用后小肠性腹泻小鼠稀便率、稀便级及腹泻指数比较（±s）

表1 不同药物作用后小肠性腹泻小鼠稀便率、稀便级及腹泻指数比较（±s）

注：与溶媒作用后比较，*P＜0.01；与易蒙停作用后比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

药物20 g/kg滇白珠提取物10 g/kg滇白珠提取物5 g/kg滇白珠提取物易蒙停溶媒n 10 10 10 10 10稀便率（%）0.53±0.13*0.62±0.11*0.64±0.07*#0.54±0.13*0.80±0.08稀便级1.00±0.00*1.03±0.11*1.09±0.20 1.04±0.09*1.21±0.10腹泻指数0.53±0.13*0.63±0.09*0.69±0.09*##0.55±0.12*0.96±0.13

2.2 不同药物作用后大肠性腹泻小鼠稀便率、稀便级及腹泻指数比较 与溶媒作用后比较，20、10 g/kg滇白珠提取物及易蒙停作用后大肠性腹泻小鼠稀便率、稀便级及腹泻指数均降低，5 g/kg滇白珠提取物作用后大肠性腹泻小鼠稀便级、腹泻指数均降低 （P均＜0.01）。见表2。

表2 不同药物作用后大肠性腹泻小鼠稀便率、稀便级及腹泻指数比较（±s）

表2 不同药物作用后大肠性腹泻小鼠稀便率、稀便级及腹泻指数比较（±s）

注：与溶媒作用后比较，*P＜0.01；与易蒙停作用后比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

药物n 稀便率（%） 稀便级 腹泻指数20 g/kg滇白珠提取物10 g/kg滇白珠提取物5 g/kg滇白珠提取物易蒙停溶媒10 10 10 10 10 0.34±0.06*0.44±0.07*#0.53±0.06##0.33±0.13*0.58±0.08 1.03±0.06*1.08±0.08*1.06±0.07*1.06±0.16*1.30±0.12 0.35±0.06*0.48±0.08*#0.57±0.06*##0.34±0.12*0.76±0.11

2.3 不同药物作用后正常小鼠胃内残留率、小肠推进率比较 见表3。

表3 不同药物作用后正常小鼠胃内残留率、小肠推进率比较（%，±s）

表3 不同药物作用后正常小鼠胃内残留率、小肠推进率比较（%，±s）

注：与溶媒作用后比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与易蒙停作用后比较，#P＜0.05。

药物20 g/kg滇白珠提取物10 g/kg滇白珠提取物5 g/kg滇白珠提取物易蒙停溶媒n 10 10 10 10 10胃内残留率53.33±12.71 52.27±15.43 51.16±18.03 54.72±14.36 44.61±15.76小肠推进率49.31± 5.94**53.14± 5.69*58.18± 9.54#47.74±11.71*58.68± 5.49

2.4 不同药物作用后胃肠功能亢进小鼠胃内残留率、小肠推进率比较 见表4。

表4 不同药物作用后胃肠功能亢进小鼠胃内残留率、小肠推进率比较（%，-x±s）

2.5 不同药物作用前后大鼠离体正常小肠张力及 张力抑制率比较 见表5。

表5 不同药物作用前后大鼠离体正常小肠张力及张力抑制率比较（±s）

表5 不同药物作用前后大鼠离体正常小肠张力及张力抑制率比较（±s）

注：与溶媒作用后比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与硫酸阿托品作用后比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

药物44.78µg/mL滇白珠提取物22.39µg/mL滇白珠提取物11.19µg/mL滇白珠提取物硫酸阿托品溶媒基础张力（g）0.60±0.07 0.60±0.04 0.59±0.07 0.62±0.08 0.61±0.09作用2.5 min张力（g）0.31±0.06**##0.33±0.06**##0.39±0.12*0.43±0.06*0.55±0.12作用2.5 min张力抑制率（%）49.01± 9.29**##44.51±11.57**#34.55±11.11**30.06±11.18**9.83± 9.69作用5.0 min张力（g）0.25±0.06**##0.27±0.05**##0.37±0.14*0.39±0.07*0.52±0.14作用5.0 min张力抑制率（%）58.52± 8.70**##54.86± 8.63**##38.15±13.54**36.36±14.27**15.33±13.11

2.6 不同药物作用前后大鼠离体张力亢进小肠 张力及张力抑制率比较 见表6。

表6 不同药物作用前后大鼠离体张力亢进小肠张力及张力抑制率比较（±s）

表6 不同药物作用前后大鼠离体张力亢进小肠张力及张力抑制率比较（±s）

注：与溶媒作用后比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与硫酸阿托品作用后比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

药物89.11µg/mL滇白珠提取物44.56µg/mL滇白珠提取物22.28µg/mL滇白珠提取物硫酸阿托品溶媒基础张力（g）0.49±0.05 0.48±0.05 0.46±0.04 0.48±0.04 0.49±0.07加入乙酰胆碱平台期张力（g）3.27±0.31 3.34±0.91 3.62±1.04 3.23±0.54 3.16±0.27作用2.5 min张力（g）1.41±0.20**##2.12±0.58*##2.84±0.72*##0.97±0.20**2.90±0.36作用2.5 min张力抑制率（%）67.25±4.49**##43.09±4.15**##24.07±6.74**##82.28±5.84**10.02±7.23作用5.0 min张力（g）1.13±0.21**#1.80±0.50*##2.41±0.61##0.87±0.20**2.52±0.47作用5.0 min张力抑制率（%）77.32± 6.83**#54.00± 5.26**##37.78± 8.31*##86.05± 6.45**24.51±11.76

3 讨论

滇白珠具有抗炎镇痛、抑菌、抗氧化等药理作用［5-6］。前期研究采用不同极性的有机溶剂对滇白珠水提取物进行萃取及活性验证，发现乙酸乙酯萃取物在抗腹泻和胃肠功能调节方面均有较好的活性，可能是滇白珠抗腹泻和胃肠功能调节的活性部位［7］。易蒙停通用名为盐酸洛哌丁胺胶囊，用于各种原因引起的非感染性急、慢性腹泻的对症治疗。此外，易蒙停可抑制肠道平滑肌的收缩，减少肠蠕动；还可减少肠壁神经末梢释放乙酰胆碱，通过胆碱能和非胆碱能神经元局部的相互作用，直接抑制蠕动反射［8-9］。因此，本研究将易蒙停作为腹泻和胃肠功能试验的阳性对照药。

番泻叶作用于大肠，可促进结肠的水和电解质净分泌，加速大肠内容物输送而致泻。蓖麻油刺激小肠，能损害肠黏膜细胞，引起炎症而致泻［10-11］。本研究结果显示，不同浓度滇白珠提取物对小肠性和大肠性腹泻小鼠均具有显著的止泻作用，其中20 g/kg滇白珠提取物的作用效果与易蒙停相当；这提示滇白珠提取物可应用于各种原因引起的腹泻治疗，具有多靶点、多机制作用的特点。

腹泻的发生与胃肠道功能息息相关。胃具有收纳食物，对食物进行酸化、研磨形成食糜，并节奏性地排送入肠的功能［12］。胃肠运动的调节涉及交感神经系统、副交感神经系统、肠神经系统等多种神经系统，其中胃肠道平滑肌细胞膜上M 胆碱能受体发挥着非常重要的作用。副交感神经末梢释放的乙酰胆碱可激活M 胆碱能受体，而胆碱酯酶抑制剂新斯的明能保护乙酰胆碱免于破坏，使胃肠道平滑肌的M胆碱能受体持续激活，造成胃肠运动机能亢进。研究显示，胃肠内容物推进速度减慢，可能由胃排空速度减慢或小肠推进速度减慢两方面因素促成的［13-14］。本研究采用新斯的明建立胃肠功能亢进小鼠模型，以炭末推进情况反映小鼠的胃肠推进功能，结果显示不同浓度的滇白珠提取物对正常小鼠和胃肠功能亢进小鼠的小肠推进率均有明显的抑制作用，并可明显增加胃肠功能亢进小鼠的胃内残留率，但是对正常小鼠的胃内残留率影响不大，这提示滇白珠提取物可能通过对胃肠道M 胆碱能受体的抑制作用发挥胃肠功能调节作用。而滇白珠提取物对正常小鼠的胃内残留率影响不明显，分析原因可能是其对胃肠亢进状态小鼠推进功能的抑制作用大于正常小鼠，也可能与其对小肠运动的抑制作用大于对胃排空的抑制作用有关。为明确滇白珠提取物对M 胆碱能受体的作用特点，本研究采用离体小肠张力实验进行验证。乙酰胆碱可兴奋小肠平滑肌运动，而阿托品为M 胆碱能受体拮抗剂，对胃肠痉挛有抑制作用［15］。本研究结果显示，不同浓度滇白珠提取物与阿托品对大鼠离体小肠平滑肌的自发张力均有显著抑制作用，同时对乙酰胆碱所造成的小肠平滑肌收缩也有明显的抑制作用。因此，滇白珠提取物与阿托品一样能竞争性拮抗乙酰胆碱所造成的M胆碱能受体作用。

综上所述，滇白珠提取物对大肠及小肠性腹泻小鼠均具有明显的止泻作用，其机制可能与通过拮抗M 胆碱能受体而增加胃内残留率、降低小肠推进速度、解除胃肠道平滑肌痉挛有关。