过表达sFRP2 基因对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及其分子机制

蒙艳，白漪，霍松

昆明医科大学附属红河医院，云南红河661000

血管内皮细胞（VECs）存在于血管内层，是抗血栓形成和抗炎的重要屏障，在维持血管稳态、调节血管运动和参与生命活动中发挥重要作用［1］。内皮细胞功能障碍可导致血管损伤，血管稳态失衡，最终导致动脉粥样硬化、高血压、冠心病等血管疾病的发生［2］。分泌型卷曲相关蛋白2（sFRP2）具有Wnt拮抗剂的作用，是一种分泌型的抗凋亡相关蛋白［3］。研究显示，在心脏成纤维细胞中sFRP2 可激活Wnt/β-catenin信号通路，减轻心肌纤维化，从而改善心脏功能［4］。在血管生成模型中，sFRP2 可抑制缺氧诱导的内皮细胞凋亡，增加内皮细胞迁移，从而诱导血管形成［5］。最近研究显示，脂多糖（LPS）可刺激人支气管上皮细胞中Wnt5a、β-catenin 表达升高，且Wnt抑制剂能抑制LPS 刺激引起的炎症反应［6］。目前，LPS 诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡已被广泛用于研究内皮细胞凋亡的体外实验模型，但是sFRP2 对LPS 诱导HUVECs 凋亡的影响及其相关机制报道较少。为此，我们于2018 年5 月—2020 年1月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：HUVECs 购自武汉普诺赛生命科技有限公司。质粒：sFRP2 过表达及阴性对照慢病毒质粒由上海吉凯基因科技有限公司构建及包装。主要试剂：TRIzol 试剂购自美国Thermo 公司，逆转录试剂盒购自北京宝日医生物技术有限公司，qPCR试剂盒购自上海东洋纺生物科技有限公司；兔抗sFRP2、兔抗Bax、兔抗Bcl-2、兔抗Wnt1 均购自美国Abcam 公司，兔抗 Cyt C、兔抗 β-catenin 及 Cyclin D1均购自美国CST 公司，β-actin 购自武汉三鹰生物技术有限公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；细胞裂解液和蛋白酶抑制剂均购自上海碧云天生物技术有限公司，BCA 试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司。

1.2 LPS 作用浓度筛选 采用CCK-8 法。将HU⁃VECs 置于含 10%FBS 的 DMEM 高糖培养基，37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。调整HUVECs 细胞密度为5×105/mL，取100 µL 接种于96 孔培养板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中，培养 24 h。将 HUVECs 分为两部分，一部分加入不同浓度 LPS（0、5、10、15、20µg/mL），另一部分作为对照细胞不予特殊处理，作用12 h。吸出原培养液，每孔加入新鲜培养液100 µL 和CCK-8 溶液10 µL，培养箱中孵育3 h。使用酶标仪读取490 nm处的光密度（OD）值，每次实验设置 3 个复孔。细胞存活指数=（OD待测孔-OD空白孔）/（OD对照孔-OD空白孔）。结果显示，加入 0、5、10、15、20µg/mL LPS 作用 12 h 的 HUVECs 细胞存活指数分别为 0.78 ± 0.10、0.91 ± 0.05、0.66 ± 0.12、0.43 ±0.04、0.28 ± 0.03，对照细胞为1.08± 0.07；加入10、15、20µg/mL LPS作用12 h的HUVECs细胞存活指数明显低于对照细胞（P均＜0.01），选择10µg/mL LPS作用12 h作为后续实验条件。

1.3 细胞分组及处理 取融合至70%～80%的HUVECs，以 1×106/孔接种至 6 孔板中，细胞贴壁18～24 h后分为过表达组和阴性对照组。过表达组和阴性对照组分别转染sFRP2过表达及阴性对照慢病毒质粒，转染48 h后加入10µg/mL LPS作用12 h。

1.4 细胞sFRP2 mRNA 表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。取两组细胞，用冰冷的PBS 离心洗涤后去除上清，向沉淀中加入1 mL TRIzol 裂解液，提取细胞总RNA，测定RNA 浓度及纯度合格后，将RNA逆转为cDNA。以cDNA 作为模板，加入酶和引物进行PCR 反应，每个样本独立重复检测3次，每次设置3 个复孔。sFRP2 引物序列：上游引物5'-GAC⁃CATTTCTGCTCCGGGAT-3'，下游引物 5'-GGGGAT⁃GCAAACGTGCAAAA-3'。内参GAPDH 引物序列：上游引物5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'，下游引物5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。采用2－ΔΔCt法计算sFRP2 mRNA相对表达量。

1.5 细胞sFRP2蛋白表达检测 采用Western blot⁃ting 法。取两组细胞，用冰冷的PBS 离心后冰上裂解20 min，BCA 试剂盒测定蛋白浓度。加入适量上样缓冲液，金属浴100 ℃煮沸5 min 使蛋白变性。定量40 µg 总蛋白，10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白电泳，电泳结束后将蛋白转至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h 以上。分别加入sFRP2（1∶1 000）和内参β-actin（1∶3 000）一抗，4 ℃孵育过夜；加入HRP标记的山羊抗兔二抗，室温孵育1.5 h。TBST 洗膜，滴加ECL 化学发光底物，化学发光成像仪显影拍照。以β-actin为内参，采用Image J软件分析条带灰度值，计算sFRP2蛋白相对表达量。

1.6 细胞凋亡能力观察 采用流式细胞术。取两组细胞，用不含EDTA 的胰酶消化，预冷PBS 洗涤2次；1 500 r/min 离心 5 min，收集沉淀，加入 500 µL缓冲液重悬细胞，制成密度为5×108/L 的细胞悬液。分别加入5µL Annexin Ⅴ（绿色荧光）和PI（红色荧光）染液，混匀后避光孵育15 min。使用流式细胞仪计算细胞凋亡率。

1.7 细胞凋亡相关蛋白及Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达检测 取两组细胞，参照1.5采用Western blot⁃ting法检测凋亡相关蛋白Bax、Cleaved Caspase-3、Bcl-2及Wnt/β-catenin 通路相关蛋白Cyclin D1、β-catenin（以上稀释比例均为1∶1 000）、Wnt1（稀释比例为1∶4 000）表达，β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法 采用Graphpad7.0 和SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞sFRP2 表达比较 过表达组与阴性对照组sFRP2 mRNA 相对表达量分别为2.69 ±0.13、1.04 ± 0.21，蛋白相对表达量分别为 3.89 ±0.18、1.05± 0.24；两组比较P均＜0.01。见图1。

图1 两组细胞sFRP2蛋白表达条带图（Western boltting法）

2.2 两组细胞凋亡率比较 过表达组与阴性对照组细胞凋亡率分别为13.32% ± 1.98%、20.90% ±1.72%，两组比较P＜0.01。

2.3 两组细胞凋亡相关蛋白及Wnt/β-catenin 通路相关蛋白表达比较 过表达组Cleaved Caspase-3、Bax及Wnt1、β-catenin、Cyclin D1表达均低于阴性对照组，Bcl-2表达高于阴性对照组（P均＜0.05）。见表1。

表1 两组细胞凋亡相关蛋白及Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达比较（±s）

表1 两组细胞凋亡相关蛋白及Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达比较（±s）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05。

组别过表达组阴性对照组Bax 2.14±0.03*4.13±0.03 Cleaved Caspase-3 2.66±0.04*3.24±0.06 Bcl-2 0.67±0.10*0.38±0.04 Wnt1 1.70±0.07*2.38±0.04 β-catenin 2.94±0.03*4.62±0.06 Cyclin D1 2.47±0.04*3.08±0.03

3 讨论

分泌型卷曲相关蛋白（sFRP）家族包含5 个成员，在胚胎发生和肿瘤发生过程中具有重要作用［7］。sFRP2 是间充质干细胞产生的分泌蛋白，在增强间充质干细胞抗凋亡能力和缺氧条件下的自我更新方面具有重要作用［8］。sFRP2 通常被认为能够将Wnt配体与卷曲受体隔离开来，而事实上sFRP2 是赖氨酸去甲基化酶2A（KDM2A）的靶基因。在许多癌症细胞中，sFRP2 启动子高甲基化伴随着Wnt 信号通路激活［9］。改善血管内皮功能是治疗动脉粥样硬化、高血压、冠心病等心血管疾病的关键。在体内炎症损伤状态下，内皮细胞半渗透性屏障破坏，导致血管内液体溢出、组织水肿和血栓形成，在这种状态下也会发生细胞骨架损伤。LPS 是革兰阴性菌细胞壁的主要促炎分子之一，可激活血管内皮细胞，使白细胞渗透血管壁，增加血管通透性［10］。内皮细胞对LPS的反应是呈Toll样受体4（TLR4）依赖性的，可导致促炎细胞因子的后续释放及黏附分子表达增加，进一步刺激炎症级联，严重时会引发系统炎症反应综合征［11-12］。本研究结果显示，≥10 µg/mL的LPS可引起HUVECs 细胞存活指数明显降低，因此选择10 µg/mL LPS 作为后续实验的作用浓度。本研究中过表达组sFRP2 mRNA和蛋白表达明显高于阴性对照组，提示成功在HUVECs中过表达sFRP2基因；过表达组细胞凋亡率及促进细胞凋亡的相关蛋白Bax 和Cleaved Caspase-3表达明显低于阴性对照组，抑制细胞凋亡的相关蛋白Bcl-2 表达明显高于阴性对照组，提示过表达sFRP2 可减少LPS 诱导的HUVECs细胞凋亡。

Wnt/β-catenin 通路在多细胞真核生物中高度保守，在细胞增殖、黏附等生理过程中具有至关重要的作用，并参与炎症性疾病、纤维化疾病和多种癌症的发生过程。Wnt通路组件的不恰当激活发生于多种疾病的发病过程中，如Wnt1、Cyclin D1、β-catenin等。研究发现，LPS 刺激可使人支气管上皮细胞中Wnt5a 和 β-catenin 表达升高，且 Wnt 抑制剂能抑制LPS 引起的人支气管上皮细胞炎症反应［6］。本研究结果显示，过表达组Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 表达均低于阴性对照组，提示sFRP2 抑制细胞凋亡的作用可能与其抑制Wnt/β-catenin通路有关。

综上所述，过表达sFRP2 可减少LPS 诱导的HUVECs 细胞凋亡，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin 信号通路有关，为改善血管内皮损伤提供了新的治疗靶点。