中晚期骨关节炎患者软骨细胞自噬相关因子表达变化及雷帕霉素对其软骨细胞自噬的影响

王浩，陈群超，殷丽丽

苏州市立医院 苏州市区域性骨质疏松指导中心，江苏苏州215000

在骨关节炎（OA）发展过程中，软骨细胞中受损的细胞器和降解的大分子物质逐渐积累，导致软骨细胞内细胞合成、分解代谢失衡，软骨细胞功能异常、生存能力下降，细胞外基质合成能力下降，从而加速了软骨细胞退变［1-2］。自噬是一种细胞自我降解并回收细胞内组分的过程，在维持细胞环境稳态和提高细胞存活率方面具有重要作用［3］。在哺乳动物细胞自噬中，与ULK1、Beclin1 和LC3 自噬相关的基因分别发挥诱导、调节、执行的作用［4］。哺乳动物中雷帕霉素靶蛋白（mTOR）可负调节自噬过程，在软骨细胞自噬的调节中发挥重要作用［5］。雷帕霉素可以抑制mTOR 信号通路的mTOR 复合物1（mTORC1）表达［6］，其是否可以诱导软骨细胞的自噬水平鲜见报道。2018 年 5 月—2020 年 5 月，本研究比较了中晚期OA 患者软骨细胞自噬相关因子的表达变化，并观察雷帕霉素对中晚期OA 患者软骨细胞自噬的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 药物：雷帕霉素购自北京索莱宝科技有限公司。主要试剂：DMEM 高糖培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶溶液、Ⅱ型胶原酶均购自美国 Hycolon 公司，TRIzol 试剂、Taq PCR 反应试剂盒均购自中国大连宝生物公司，dNTP Promega、逆转录试剂盒均购自加拿大Fermentas 公司；抗ULK1、抗Beclin1、抗LC3均购自英国Abcam公司。引物：自噬相关基因 ULK1、Beclin1、LC3 及内参 β-actin 引物均由上海生工生物工程有限公司设计合成。

1.2 标本获取及分组 根据Kellgren and Lawrence影像学诊断标准，选择我院截肢手术或膝关节置换术中获得的膝关节正常软骨标本5 例份（正常对照组）、中期OA 软骨标本10 例份（中期OA 组）、晚期OA 软骨标本10 例份（晚期OA 组）。排除既往有膝关节感染性疾病和明显关节外伤患者、多类型关节炎（继发性骨关节炎、痛风性关节炎、类风湿关节炎）患者的膝关节软骨标本。本研究通过南京医科大学附属苏州市立医院伦理委员会审核，患者均签署知情同意书。

1.3 软骨细胞分离与培养 取各组软骨标本，生理盐水反复冲洗，转移至盛有DMEM 培养基的离心管中，在低温条件下尽快转运至实验室进行细胞分离。在无菌的50 mL 离心管中放入适量软骨组织，加入少量培养基直至样品浸没；将小于1 mm3的小块软骨用无菌生理盐水清洗并干燥，加入0.25%胰蛋白酶消化并离心（1 000 r/min，离心半径6 cm，离心3 min），加入0.2%胶原酶溶液，37 ℃水浴中摇动并消化；使用无菌200 目不锈钢无菌滤网过滤并离心（1 000 r/min，离心半径6 cm，离心5 min），用无菌生理盐水悬浮沉淀细胞，并重复离心1次（1 000 r/min，离心半径6 cm，离心5 min）。将沉淀细胞悬浮于20% FBS 培养基中，以（0.5～2）×105/mL 接种在烧杯或培养皿中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养，按时更换培养液。

1.4 软骨细胞 ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。取各组软骨细胞，采用TRIzol 法提取总RNA，通过核酸蛋白质分析仪检测总RNA 纯度以及RNA 片段的完整性。采用逆转录试剂盒将总RNA 逆转录为cDNA，PCR 试剂盒进行检测。PCR反应体系30µL：10×buffer（Mg2+free）3 µL，MgCl2（25 mmol/L）3 µL，dNTP（25 mmol/L）0.36 µL，上、下游引物（10 µmol/L）各 1 µL，探针0.6 µL，Taq 酶（5 U/µL）0.3 µL，ddH2O 18.74 µL，cDNA 2 µL。PCR 反应条件：95 ℃预变性 2 min，95 ℃变性 20 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共循环 30 次。以 β-actin 为内参，采用 2－ΔΔCt法计算各组ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 相对表达量，其引物序列、扩增长度见表1。

表1 ULK1、Beclin1、LC3及β-actin的引物序列及扩增长度

1.5 软骨细胞ULK1、Beclin1、LC3 蛋白表达检测采用Western blotting法。取各组软骨细胞，使用预冷的蛋白提取液提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度；十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转移后迅速去膜，并在TBST溶液中洗涤3 min，封闭1 h；加入 ULK1、Beclin1、LC3 一抗（稀释比例均为1∶500），室温条件下孵育2 h，TBST洗涤；加入二抗（稀释比例均为1∶500），室温条件下孵育2 h，TBST洗涤。ECL显色剂曝光、显影，采用Quantity One凝胶图像分析软件测定目标蛋白条带灰度值和内参条带灰度值，计算目标蛋白相对表达量。

1.6 雷帕霉素对各组软骨细胞ULK1、Beclin1、LC3表达影响的观察

1.6.1 雷帕霉素处理 取各组传至2 代的软骨细胞，以1×105/孔接种到6 孔板中，孔板中添加适量低糖DMEM 培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞融合度达30%～40%时，分别向细胞中加入等体积无血清培养基（记做0 µmol/L 雷帕霉素）及1、5、10µmol/L雷帕霉素。

1.6.2 雷帕霉素处理后软骨细胞ULK1、Beclin1、LC3表达检测 各组细胞经雷帕霉素处理后，将孔板置于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养；6 h后吸弃培养基，每孔加入2 mL含10%FBS的新鲜完全培养基继续培养48 h。参照1.4 采用实时荧光定量PCR 法检测细胞ULK1、Beclin1、LC3 mRNA表达，参照1.5采用Western blotting法检测细胞ULK1、Beclin1、LC3蛋白表达。

1.7 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料以-x±s表示，多组间比较采用方差分析，组间比较和组内比较分别采用成组t检验和配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白表达比较 见表1。

表1 各组细胞ULK1、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表达比较（±s）

表1 各组细胞ULK1、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表达比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与中期OA组比较，#P＜0.05。

组别正常对照组中期OA组晚期OA组ULK1 mRNA 0.001 3±0.000 4 0.000 6±0.000 2*0.000 2±0.000 1*#蛋白0.297 0±0.018 3 0.093 3±0.005 0*0.029 0±0.001 0*#Beclin1 mRNA 0.019 6±0.007 1 0.008 4±0.001 9*0.002 6±0.000 9*#蛋白0.947 0±0.007 0 0.853 7±0.011 7*0.376 3±0.003 5*#LC3 mRNA 0.003 7±0.001 0 0.001 3±0.000 3*0.000 7±0.000 2*#蛋白0.574 7±0.002 3 0.324 0±0.007 9*0.068 7±0.002 5*#

2.2 各组细胞经不同浓度雷帕霉素处理后ULK1、 Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表达比较 见表2。

表2 各组细胞经不同浓度雷帕霉素处理后ULK1、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表达比较（±s）

表2 各组细胞经不同浓度雷帕霉素处理后ULK1、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表达比较（±s）

注：与同组加入0µmol/L雷帕霉素比较，*P＜0.05；与正常对照组加入同浓度雷帕霉素比较，#P＜0.05；与中期OA组加入同浓度雷帕霉素比较，△P＜0.05。

组别正常对照组0µmol/L雷帕霉素1µmol/L雷帕霉素5µmol/L雷帕霉素10µmol/L雷帕霉素中期OA组0µmol/L雷帕霉素1µmol/L雷帕霉素5µmol/L雷帕霉素10µmol/L雷帕霉素晚期OA组0µmol/L雷帕霉素1µmol/L雷帕霉素5µmol/L雷帕霉素10µmol/L雷帕霉素ULK1 mRNA 0.001 3±0.000 4 0.001 8±0.000 5 0.002 9±0.000 6*0.003 2±0.000 6*0.000 6±0.000 2#0.001 1±0.000 3#0.002 1±0.001 1*0.002 9±0.000 9*0.000 2±0.000 1#△0.000 3±0.000 1#△0.000 4±0.000 2#△0.000 8±0.000 3*#△蛋白0.361 0±0.002 6 0.545 0±0.031 7*0.804 3±0.036 2*0.899 0±0.041 6*0.279 3±0.015 3#0.597 3±0.009 6*0.647 7±0.030 9*#1.028 0±0.035 9*#0.050 0±0.004 4#△0.075 0±0.006 1#△0.132 7 ± 0.022 7*#△0.201 0 ± 0.032 7*#△Beclin1 mRNA 0.019 6±0.007 1 0.024 1±0.006 1 0.039 9±0.006 7*0.042 9±0.011 5*0.008 0±0.001 6#0.012 6±0.002 4#0.020 7±0.006 9*#0.026 7±0.005 0*#0.002 7±0.000 7#△0.003 2±0.000 8#△0.003 9±0.001 4#△0.005 4±0.000 8*#△蛋白0.537 3±0.031 0 0.779 3±0.063 7*0.945 3±0.058 9*0.999 3±0.043 5*0.463 7±0.014 2#0.887 3±0.014 4*#0.932 0±0.023 0*1.016 7±0.038 0*0.190 0±0.004 4#△0.230 7±0.008 4#△0.290 0±0.021 5#△0.484 7±0.105 1*#△LC3 mRNA 0.003 7±0.001 0 0.004 8±0.000 8 0.007 7±0.001 9*0.008 4±0.001 0*0.001 3±0.000 3#0.002 2±0.000 5#0.003 9±0.000 9*#0.005 4±0.001 4*#0.000 7±0.000 2#△0.000 9±0.000 3#△0.001 3±0.000 4#△0.002 2± 0.001 0*#△蛋白0.625 3±0.025 6 0.750 7±0.032 5*0.954 0±0.047 7*1.061 3±0.040 6*0.372 3±0.023 0#0.730 3±0.046 6*0.931 7±0.008 4*1.110 7±0.178 0*0.164 7±0.023 1#△0.202 7±0.014 2#△0.225 0±0.020 8#△0.538 0 ± 0.065 2*#△

3 讨论

OA 是一种退行性疾病，会影响包括软骨、软骨下骨和滑膜在内的整个关节，最终使关节软骨发生退行性改变［7］。关节软骨由少量的软骨细胞和丰富的细胞外基质构成，软骨细胞的正常功能状态在维持代谢稳态和细胞外基质的结构完整性中具有重要作用［8］。因此，软骨细胞在关节软骨的发育形成、退变中扮演重要角色。自噬可以不断降解自身细胞器和受损的大分子物质，因此是细胞自我保护的机制之一。自噬在软骨细胞的成熟和稳态中也具有重要作用。本研究结果发现，中期OA 组、晚期OA 组细胞 ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白相对表达量均低于正常对照组，且晚期OA 组降低更明显；说明随着OA 的进展，软骨细胞自噬相关基因ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白表达逐渐降低；提示自噬是软骨细胞的保护机制，当软骨细胞受损后，自噬水平被抑制，进一步加速了OA 的进程。这与CAR⁃AMÉS等［9］、LOTZ等［10］的研究结果一致。

雷帕霉素是临床上常用的自噬诱导剂。CAR⁃AMÉS 等［9］使用雷帕霉素体外处理软骨机械损伤模型，发现其自噬相关基因蛋白表达显著增加，软骨细胞凋亡和蛋白聚糖损失显著减少。雷帕霉素可能通过调节mTOR 信号通路，参与细胞自噬和减慢软骨细胞变性。但OA 是由体内和体外多种因素引起的，仅基于实验室获得的软骨模型可能无法真正替代人类的OA 软骨。因此，本研究使用雷帕霉素干预人OA 软骨细胞。由于早期OA 软骨标本获取困难，本研究仅观察了中晚期OA 软骨细胞的自噬水平。结果显示，与同组加入0µmol/L 雷帕霉素处理后比较，正常对照组、中期 OA 组经 5、10 µmol/L 雷帕霉素处理后 ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白表达均升高，晚期OA 组经10µmol/L 雷帕霉素处理后ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白表达均升高；说明雷帕霉素可促进正常软骨细胞及中晚期OA 患者软骨细胞的自噬过程。本研究结果显示，与经相同浓度雷帕霉素处理后的中期OA 组比较，晚期OA 组ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白表达均降低；说明雷帕霉素在中期OA 软骨细胞中具有更强的自噬诱导作用，而对于晚期OA 软骨细胞的自噬诱导作用明显减弱。分析原因，OA 软骨细胞自噬受到抑制，可预防性地发生细胞凋亡，晚期OA 软骨细胞降解、功能异常、自噬过程受阻更明显，因此雷帕霉素调节晚期OA软骨细胞自噬的作用受到限制［11-12］。

CHANG 等［13］研究显示，在正常氧含量条件下，自噬诱导剂雷帕霉素可上调正常软骨细胞自噬，降低细胞凋亡率；而在低氧条件下，自噬抑制剂3-MA可下调OA 软骨细胞自噬，降低细胞凋亡率；提示上调正常软骨细胞自噬水平能促进软骨细胞生存，而上调OA 软骨细胞自噬则促进软骨细胞凋亡。而CARAMÉS 等［9］及 SASAKI 等［11］研究发现，雷帕霉素可上调OA 软骨细胞自噬，降低细胞凋亡率。这些结果之间的差异表明，某些外部因素能够调节自噬对细胞增殖活性的影响。IGLEWSKI 等［14］研究表明，自噬对细胞存活的影响取决于细胞外刺激的类型。当细胞暴露于DNA 损伤剂、内质网应激和放射性环境中时，自噬活性增强有助于细胞存活；而当细胞处于低氧、砒霜作用等环境中时，自噬活动增强则促进细胞凋亡。因此，雷帕霉素调节软骨细胞自噬从而影响细胞凋亡的具体机制仍有待进一步研究。