烤鸡货架期优势菌鉴定及其防腐研究

包桂凤，钱琦峰，王向阳，顾 双

（浙江工商大学食品与生物工程学院 杭州310018）

散装烤鸡中蛋白质和水分含量高[1-3]，在高温季节易腐败变质[4-5]。如果进行热灭菌，会严重影响其口感、风味[6]。目前物理的防腐方法还不成熟，难以用于散装烤鸡[7-8]。可使用国家标准允许的防腐剂，通过复配来延长烤鸡货架期。

前人对新鲜肉和肉制品的防腐有一些研究。如：孟良玉等[9]将蜂胶提取液对猪肉进行涂抹保鲜，在37 ℃下可保鲜贮藏24 h，在0～4 ℃低温下可保鲜贮藏12 d 以上。何叶子等[10]使用添加壳聚糖和Nisin 的衬垫，显著抑制了被包装鲜肉中微生物的生长，减缓了总挥发性盐基氮（TVB-N）含量、硫代巴比妥酸（TBARS）值和pH 值的增长速率，降低了蒸煮损失率，可保持较好的硬度和颜色，显著延长了保质期。康怀彬等[11]将烧鸡用Nisin、溶菌酶、乳酸钠、双乙酸钠复合浸泡，然后真空包装，其保质期达15～20 d。黄文垒[12]将鱼香肉丝用Nisin、茶多酚、纳他霉素、丁香桂皮浸提液复合天然保鲜液处理，室温下贮藏保质期延长4 倍。目前国家标准不允许新鲜肉采用防腐剂处理，而对调理肉和肉制品允许使用。由于散装烤鸡等肉制品缺少防腐剂处理研究，因此也缺少实践应用。

导致烤鸡腐败的微生物种类尚不清楚，本文对其进行了鉴定，并应用国家标准允许的天然和化学防腐剂，例如乳酸钠[13]、Nisin[14]、纳他霉素[15]、蜂胶[16-17]、水溶性壳聚糖[18-19]处理，模拟夏日条件进行抑菌试验。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

烤鸡，购自杭州市西湖区文一路物美大卖场；纳他霉素（含50%乳糖），DANISCO 公司；蜂胶（纯度80%），河南长葛市中龙蜂产品加工厂；水溶性壳聚糖（脱乙酰度>85%），宁波市镇海海鑫生物制品有限公司；Nisin （含水效价：1.192×106IU/g），浙江银象生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

ECLIPSE TE2000-S 生物显微镜，日本Nikon公司；ECLIPSE TE2000-S 生物显微镜，日本Nikon 公司；牛津杯（内径6 mm±0.1 mm，外径7.8 mm±0.1 mm），江苏三爱思科学仪器有限公司；CM-14 斩拌机，西班牙MAINCA 公司；珠江LRH-150-S 培养箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司；拍打均质机，西班牙IUL 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 腐败菌分离鉴定 取10 g 样品加90 mL水，拍打1～2 min。吸取1 mL，加9 mL 水，如此制备系列稀释样品匀液。接种至牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯琼脂培养基平板上，36 ℃下培养2～3 d，统计不同形态菌落的绝对数和相对数。挑取单菌落至新的平板培养基，纯化和培养单菌落。

细菌鉴定[20-22]：在细菌培养基培养2 d 后，得到3 种细菌菌株。进行革兰氏染色、细菌芽孢染色、耐酸染色试验，显微镜下观察其形态特征。测定细菌生理生化特性，进行MR 试验、V.P 试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验、需氧厌氧发酵试验、柠檬酸盐试验、尿素利用试验、酪蛋白水解试验、石蕊牛奶还原试验、过氧化氢酶试验、糖发酵管（蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、甘露醇）试验来测定其生理生化特征，鉴定菌种。

真菌鉴定[23-24]：在PDA 培养基培养2 d 后，分离得到1 种霉菌菌株。根据孢子梗和孢子的形态和大小等鉴定。

1.3.2 抑菌圈试验 根据GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[25]选择5 种防腐剂的系列质量分数，对3 种分离得到的细菌和1 种霉菌，进行抑菌圈试验，见表1。抑制圈直径=无菌区直径-牛津杯外部直径。

防腐剂的配制：纳他霉素质量分数不包括50%的乳糖，其添加乙醇，并加2 滴吐温80，再加水。蜂胶溶于30%乙醇，再加水配制。其最终乙醇质量分数与对照相同。壳聚糖用水配制，用1%醋酸调pH 5。另外设置pH 5 醋酸为壳聚糖的对照。乳酸钠和Nisin 用水配制。每个平板加6.0 mL 培养基，加细菌0.1 mL 1×107菌液，霉菌用1×107孢子悬浮液。放入牛津杯，在杯内分别加入0.2 mL上述质量分数的防腐剂，纳他霉素添加于霉菌培养基，其它4 种添加于细菌培养基。细菌36 ℃培养2～3 d，霉菌28 ℃培养4～5 d，测量抑菌圈直径。

1.3.3 烤鸡微生物抑制试验 将100 g 烤鸡在各种防腐液中浸泡30 s，取出后沥干5 min。置于36℃贮藏0，24，48，72 h 进行菌落总数及霉菌总数测定。

1.3.4 复合保鲜剂正交配比试验 根据四因素三水平进行正交试验。正交表如表3所示。对正交结果进行分析。

1.4 测定方法

菌落总数按照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[26]，霉菌总数按照GB 4789.15-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》[27]方法测定。

表1 防腐剂及其质量分数（%）Table 1 Preservatives and their mass percent （%）

表2 防腐剂及添加质量分数（%）Table 2 Preservatives and added mass percent （%）

表3 复合防腐剂正交表Table 3 Orthogonal table of composite preservative

1.5 数据统计

每个数据测定3 个平行，试验数据用Excel进行初步整理与计算，试验图用Origin 8.0 绘制，试验数据结果均用平均数±标准差表示。用SPSS 17.0 进行显著性分析，显著性水平设置为P＜0.05。

2 结果与讨论

2.1 优势菌分离鉴定

3 种菌均为芽孢杆菌属。对照伯杰氏手册，1号菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），2、3 号菌株为短小芽孢杆菌 （Bacillus pumilus）不同菌株。烤鸡中1 号菌株所占比例达到68%，2 号菌株为15%，3 号菌株为14%。

4 号菌株的菌落开始为乳白色，近似圆形，中间向上略有突起，边缘凹凸不平，表面有褶皱。显微镜下观察，菌丝发达，分支较多，菌体有隔断，孢子梗头部可以确定是曲霉属，再根据孢子着生形态、层数，孢子大小和形状。确定4 号菌株为亮白曲霉（Aspergillus candidus）。

表4 3 种细菌菌株的形态学特征Table 4 The morphological characteristics of 3 bacterial strains

表5 3 种细菌菌株的生理生化特性Table 5 Physiological and biochemical characteristics of 3 bacterial strains

2.2 防腐剂对优势菌抑制效果

蜂胶抑制枯草芽孢杆菌效果最好，其次是Nisin。同时，蜂胶抑制短小芽孢杆菌的效果也最好。Nisin 和壳聚糖抑制短小芽孢杆菌（2 号、3 号菌）效果类似。纳他霉素能够很好地抑制4 号菌亮白曲霉生长，抑菌直径大。乳酸钠和乙醇对照组的抑菌效果类似，有一定抑菌作用，但效果不明显。乳酸钠对优势菌的抑制效果较差。0.4%蜂胶、0.015%纳他霉素、0.025% Nisin、0.5%壳聚糖均有较好的抑菌效果。

表6 防腐剂对枯草芽孢杆菌（1 号细菌）的抑菌圈直径（mm）Table 6 Inhibitory diameter of preservatives on Bacillus subtilis （bacteria No.1）（mm）

表7 防腐剂对短小芽孢杆菌（2 号细菌）的抑菌圈直径（mm）Table 7 Inhibitory diameter of preservatives on Bacillus pumilus （bacteria No.2）（mm）

表8 防腐剂对短小芽孢杆菌（3 号细菌）的抑菌直径（mm）Table 8 Inhibitory diameter of preservative on Bacillus pumilus （bacteria No.3）（mm）

表9 防腐剂对亮白曲霉（4 号霉菌）的抑菌直径（mm）Table 9 Inhibitory diameter of preservative to Aspergillus candidus （fungi No.4）（mm）

2.3 不同防腐剂对烤鸡菌落总数的抑制

对照组放置1 d，其菌落总数达到了（6.08±0.07）lg （CFU/g），已超过国标要求的菌落总数≤50 000 CFU/g，即4.70 lg （CFU/g）。添加Nisin、蜂胶的试验组放置2 d 依然符合国家标准，放置3 d时超标。壳聚糖处理放置2 d 已超标。所有试验组与对照组相比，均有极显著性差异（P＜0.001）。添加Nisin 的试验组1、2 的抑菌能力与试验组3、4、5 有显著性差异（P＜0.05）。Nisin 质量分数需≥0.035%。添加蜂胶的试验组1 的抑菌能力与试验组4、5 有显著性差异（P＜0.05）。蜂胶的质量分数需≥0.3%。添加壳聚糖的试验组1 的抑菌能力与试验组3、4、5 之间有显著性差异（P＜0.05）。水溶性壳聚糖的质量分数需≥0.4%。对照组放置1 d，其霉菌、酵母菌菌落总数为2.82 lg （CFU/g）。试验组放置3 d 才接近2.82 lg （CFU/g）。所有试验组与对照组有极显著性差异（P＜0.001）。试验组1、2 与试验组3、4、5 之间有显著性差异（P＜0.05）。纳他霉素≥0.015%后抑制霉菌效果较好，该添加量在国标规定的范围内。

图1 Nisin 对烤鸡菌落总数的抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect of Nisin on total number of colonies of roast chicken

图2 蜂胶对烤鸡菌落总数的抑菌效果Fig.2 Inhibitory effect of propolis on total number of colonies of roast chicken

图3 水溶性壳聚糖对烤鸡菌落总数的抑菌效果Fig.3 Antibacterial effect of water-soluble chitosan on total number of colonies of roast chicken

图4 纳他霉素对烤鸡霉菌的抑菌效果Fig.4 Inhibitory effect of natamycin on fungi of roast chicken

2.4 复合防腐剂对菌落总数和真菌的抑制

贮藏前期菌落总数增加缓慢，36 h 后菌落总数增加变快。从组1 至组9，菌落总数依次降低，组9 菌落总数最低。组1 菌落总数与组7、8、9 差异显著（P＜0.05）；组9 菌落总数与组1～6 差异显著（P＜0.05）；组7 菌落总数与组1～5 差异显著（P＜0.05）。组7～9 试验组对细菌的抑制作用较好，且蜂胶添加量最大。

蜂胶对菌落总数的抑制作用较大。纳他霉素抑菌效果最差，因其只能抑制真菌，而对细菌几乎没有抑制作用。根据极差R，各防腐剂抑制的主次顺序为：蜂胶＞水溶性壳聚糖＞Nisin＞纳他霉素。最优组为蜂胶3、水溶性壳聚糖3、Nisin 2、纳他霉素1。

贮藏前期真菌增加速度慢，48 h 后速度变快。组1、5、9 的真菌最高，组1 与组2、3、4、8 差异显著（P＜0.05）；组3、4、8 真菌最低。组3、4、8 与组1、2、5、6、7、9 差异显著（P＜0.05）。组3、4、8 对真菌生长的抑制作用较好，而这几个组正好是纳他霉素添加量最高的组。空白对照组在36 ℃下，24 h 就发现烤鸡表面出现霉菌菌落。霉菌、酵母菌菌落总数达3.67 lg （CFU/g），说明加入复合防腐剂的效果非常好。

根据极差R 大小，各防腐剂抑制真菌的主次顺序为：纳他霉素＞Nisin＞水溶性壳聚糖＞蜂胶。最优组为蜂胶1、水溶性壳聚糖1、Nisin 1、纳他霉素3。

表10 不同试验组贮藏期内菌落总数的变化[lg（CFU/g）]Table 10 Changes in the total number of colonies during the storage period in different experimental groups [lg（CFU/g）]

表11 菌落总数正交直观分析表Table 11 Orthogonal intuitive analysis table of total number of colonies

表12 不同试验组贮藏期内真菌菌落总数的变化[lg（CFU/g）]Table 12 Changes of the total number of fungi colonies during the storage period in different experimental groups [lg（CFU/g）]

表13 真菌菌落总数正交直观表Table 13 Orthogonal intuitive table of total number of fungi colonies

3 结论

导致烤鸡变质的优势菌有细菌和霉菌，细菌分别是枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌，霉菌是亮白曲霉。蜂胶对细菌抑制能力强，纳他霉素对霉菌抑制能力强。Nisin、水溶性壳聚糖对细菌也有较强的抑制作用。36 ℃下，Nisin、蜂胶单因素添加可以延长烤鸡的菌落总数合格时间至2 d 以上。比空白组不足12 h 的货架期延长了4 倍。在36 ℃下，空白组1 d 后就能看到明显的白曲霉菌落，而添加纳他霉素后3 d 才出现白曲霉菌落。最优组对烤鸡微生物的抑制超过60 h，与空白组不足12 h相比，延长了5 倍以上。