碱性蛋白酶降解鲢鱼肌原纤维蛋白的组学分析

刘 瑞，李睿智，王 嵬，仪淑敏*，励建荣，李学鹏，徐永霞

（1 渤海大学食品科学与工程学院 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心国家鱼糜及鱼糜制品加工技术研发分中心 辽宁锦州121013 2 渤海大学实验管理中心 辽宁锦州121013）

鲢鱼（Silver carp，Hypophthalmichthys molitrix），脊索动物门、硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、鲢属，是著名的四大家鱼之一，产量仅次于草鱼，2019年年产值381.03 万t[1]。鲢鱼中含有丰富的优质蛋白质和多种不饱和脂肪酸，包括8 种必需氨基酸和组氨酸，其中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的含量达到海水鱼标准；鲢鱼中还含有钾、钠、钙、镁、磷等常量元素以及锌、硒、铁等微量元素[2-3]。其肉薄刺多，土腥味较重，市场上主要以活体的销售为主，部分鲢鱼被加工成冻品鱼片、鱼粉制品及鱼丸，使用率不高，还造成很多的垃圾，破坏环境，资源浪费严重[4]，消费者接受程度低于其它水产品。通过加工成鱼糜制品，可提高其经济价值[5]。

鱼糜制品在冻藏过程中易腐败变质。其腐败机制涉及生物、化学、物理等变化，其中，微生物是引起腐败的主要因素，特别是新鲜和冷冻食品，由于未经过高温处理或其它处理方式消毒，附着在食品中的微生物生长繁殖，最终导致食品腐败变质[6]。Lücking 等[7]对369 种腐败的食品样品的研究发现，蜡样芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌占主导地位，还检测到少数的海水芽胞八叠球菌，同时证明地衣芽胞杆菌具有一定的蛋白水解酶活性，能够分解利用蛋白质。本团队以往的研究发现，地衣芽孢杆菌是造成鲢鱼糜制品腐败的优势腐败菌之一[8]。1945年，瑞士Rose 等[9]在地衣芽胞杆菌中发现碱性蛋白酶，它是一类在碱性条件下能够水解蛋白质肽键的酶类。赵巧灵[10]利用差异蛋白质组学技术研究金枪鱼在冷藏过程中的品质变化，鱼肉组织蛋白酶加速肌原纤维结构蛋白质降解过程，破坏鱼肉组织结构，导致鱼肉品质下降。

本试验中，利用差异蛋白质组学技术研究地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶对鲢鱼肌原纤维蛋白的降解作用，寻找降解过程中的肌原纤维蛋白差异蛋白点，并利用GO 功能注释及KEEG 通路分析鲢鱼肌原纤维蛋白微生物降解的途径，为今后鲢鱼等水产品的微生物腐败研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

活鲢鱼购于辽宁省锦州市林西路水产市场，1 h 内运送至实验室，立即冰水致死。

固相pH 值梯度 （immobilized pH gradient，IPG）预制干胶条（pH 4～7，17 cm）、载体两性电解质（pH 3～10、pH 5～8、pH 4～6 和pH 5～7）、Trisbase、苯甲基磺酰氟（PMSF）、尿素、硫脲、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺、3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）所需丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠（SDS）、矿物油、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵、甘氨酸均购买自美国Bio-Rad 公司；甘油、溴酚蓝、琼脂糖均为国产分析纯，所有溶液均以Milli-Q 超纯水系统制备的超纯水为溶剂。

1.2 仪器与设备

5800MALDI-TOF/TOF 质谱仪，ABSCIEX 公司；UV-2550 型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；MILLI-QREFERENC 超纯水系统，美国密理博公司；GS-800-TM 校正型光密度扫描仪，美国Bio-Rad 公司；DL-1005 型低温冷却液循环系统，上海汉诺仪器有限公司；PROTEAN IEF 等电聚焦电泳仪，美国Bio-Rad 公司；PROTEAN83ⅡXL 电泳槽，美国Bio-Rad 公司；ZD-9556 型水平脱色摇床，常州市凯航仪器有限公司；FE20 pH 计，梅特勒-托利多仪器有限公司；SORVALL Stratos 冷冻高速离心机，美国Thermo 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

1.3.1.1 鲢鱼肌原纤维蛋白提取 参考李学鹏等[11]的方法，取鱼肉20 g 并绞碎。加入5 倍体积10 mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.2），高速均质2 min，每隔30 s，停30 s。在5 000 r/min、4 ℃条件下离心15 min。取沉淀，在沉淀中加入3 倍体积的Tris-HCl （含0.6 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris，pH 7.2）缓冲液，高速均质，后在4 500 r/min、4 ℃条件下离心15 min，双缩脲法测定其浓度。取上清液贮藏在-80 ℃冰箱中备用。

1.3.1.2 碱性蛋白酶处理 将干酶粉稀释至0.01 g/mL，并取20 mL 肌原纤维蛋白溶液，添加相当于蛋白质质量0.1%的碱性蛋白酶酶液，置于磁力搅拌器上，分别在4 ℃和25 ℃下反应。碱性蛋白酶处理时间分别为：4 ℃选取0，1，2 h；25 ℃选取0，0.5，1 h。反应结束后立即加入适量50 mmol/L PMSF 抑制酶活。

1.3.2 双向电泳

1.3.2.1 等电聚焦程序 参考Bio-Rad 公司双向电泳操作技术手册及本团队前期已探索出鲢鱼肌原纤维蛋白的双向凝胶电泳技术（two dimensional gel electrophoresis，2-DE）[12]进行试验。将适量的已定量蛋白质溶液与水化上样缓冲液（含7 mol/L尿素、2 mol/L 硫脲、4% CHAPS、65 mmol/L DTT、0.2%载体两性电解质和0.001%溴酚蓝）充分混合，采用17 cm，pH 4～7 的IPG 预制干胶条进行等电聚焦，100 μg，300 μL 主动水化上样，显色方式为硝酸银染色。等电聚焦程序参数设置如表1所示。

表1 等电聚焦程序参数设置（20 ℃）Table 1 Setting of IEF parameters （20 ℃）

1.3.2.2 胶条平衡 等电聚焦结束后，每根胶条用6 mL 胶条平衡缓冲液Ⅰ〔6 mol/L 尿素、2%SDS、0.375 mol/L Tris-HCl （pH 8.8）、20%甘油和2% DTT〕和缓中液Ⅱ[6 mol/L 尿素、2%SDS、0.375 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）、20%甘油和2.5%碘乙酰胺]进行胶条平衡，每次14 min。

1.3.2.3 第二向SDS-PAGE 垂直凝胶电泳 将平衡完毕的胶条于1×电极缓冲液 （含3 g/L Trisbase、14.4 g/L 甘氨酸、1 g/L SDS）中洗去多余平衡液，分别转移至提前制好的第二向10%，12%，15%聚丙烯酰胺分离胶上端，并加入低熔点琼脂糖封胶液（0.5%低熔点琼脂、25 mmol/L Tris-base、192 mmol/L 甘氨酸、0.1% SDS 和0.001%溴 酚蓝），排除气泡，待其彻底凝固后，转移至垂直电泳槽中，恒压进行第二向SDS-PAGE，程序见表2。

1.3.2.4 银染、凝胶成像及分析 采用参考文献[13-15]的方法并略有修改。将银染后的凝胶转至GS-800 凝胶扫描成像仪投射平台上。

采用PDQuest 8.0 二维凝胶图像专业分析软件对所得图像进行背景消减、蛋白点检测和匹配等处理，寻找差异蛋白点。

1.3.3 差异蛋白点的质谱鉴定

1.3.3.1 酶解 参考Addis 等[16]和Bernevic 等[17]的方法，从银染的凝胶上得到蛋白质点，放入硅化处理过的1.5 mL 微量离心管中，用超纯水反复漂洗后，对该蛋白点进行胶内酶切。

1）脱色 在放有蛋白点的离心管中，加入50 μL 脱色液[15 mmol/L K3Fe（CN）6溶于50 mmol/L Na2S2O3中]，将蛋白点的棕色脱色至淡绿色，用超纯水漂洗以终止反应，直至蛋白点变为无色透明。然后将蛋白点所附着的丙烯酰胺切碎，用100 mmol/L NH4HCO3漂洗，并用100%乙腈（色谱纯）脱色至丙烯酰胺凝胶颜色变白，随后将其置于冷冻真空干燥器中进行冻干。

2）酶解 用pH 8.0 的胰蛋白酶液 （以50 mmol/L 碳酸氢铵溶液为溶剂）将冻干的样品于37℃酶解过夜。每个蛋白点胰蛋白酶用量根据蛋白点大小，每个蛋白点约40～100 ng 胰蛋白酶。

3）萃取 酶解后的肽段用60 μL 5% TFA和50%乙腈进行萃取，重复2 次，每次15 min，合并萃取液并真空抽干。

4）样品复溶与脱盐 采用0.1% TFA 溶液将干燥后的样品再次复溶，并用Zip TIP 移液嘴脱盐。将1 μL 除盐后的样品置于质谱样品板上进行自然干燥，进行MALDI-TOF/TOF 分析，检测条件见表3。

1.3.3.2 质谱测定 将酶解好的样品用MALDITOF/TOF 质谱仪（美国Applied Biosystems）对样品进行测定，选择合适的仪器参数获得肽质量指纹图谱（PMF）。

1.4 数据分析

所有数据至少为3 次平行试验的平均值。采用Origin9.0 绘图，SPSS19.0 进行显著性检验，P<0.01 为极显著，P<0.05 为显著。多重比较采用Duncan 检验。

表2 第二向SDS-PAGE 凝胶电泳程序Table 2 Parameters of second to SDS-PAGE program

表3 MALDI-TOF/TOF 检测条件Table 3 The detecting conditions of MALDI-TOF/TOF

2 结果与分析

2.1 鲢鱼肌原纤维蛋白降解过程中的2-DE 图谱

如图1所示，随着降解过程的进行，0 h 时处理组蛋白点均较少，4 ℃-1 h 和25 ℃-0.5 h 时，蛋白点增多，同时低分子蛋白区出现蛋白点，表明肌原纤维蛋白被降解成小分子多肽或蛋白质。随后，在4 ℃-2 h 和25 ℃-1 h 时，蛋白点变得模糊，并发生拖尾等聚焦不彻底的情况。这可能是由于降解过程中蛋白质二、三级结构发生变化，出现蛋白质聚集和氨基酸改性所致[18]。

利用PDQuest 软件对4 ℃处理0，1，2 h 及25℃处理0，0.5，1 h 样品的2-DE 图谱进行重复性和匹配率的检测，对2-DE 图谱蛋白点表达差异进行比较分析。差异蛋白点检测标准为：若某一个蛋白点在不同组之间的相对丰度的比值大于2，且t-test P<0.05，即认为该点为差异蛋白点。经过分析得到，4 ℃组和25 ℃组分别存在45 个、30 个差异蛋白质点，如图4所示。差异蛋白点的局部放大图如图2及图3所示。

2.2 差异蛋白点质谱鉴定及分析

图1 鲢鱼肌原纤维蛋白降解过程中蛋白质图谱变化（4 ℃，25 ℃）Fig.1 Changes of protein pattern of silver carp myofibrils during protein degradation （4 ℃，25 ℃）

图2 4 ℃差异蛋白点部分放大图Fig.2 Local amplification of differentially expressed protein spots in the 2-DE maps of degradation at 4 ℃

图3 25 ℃差异蛋白点部分放大图Fig.3 Local amplification of differentially expressed protein spots in the 2-DE maps of degradation at 25 ℃

在对如图4所示的总计75 个差异蛋白质点割胶取点的过程中，删除掉4 和25 ℃重复的点，以及割胶失败的点，共获得独立可进行质谱鉴定的蛋白质点24 个。其中4 ℃组中共有14 个蛋白点，分别是点3504，0510，6406，3413，1005，1105，1410，0014，1012，0007，6512，5506，0116，6407；25℃组中共有10 个蛋白点，分别是2402，2304，5302，5104，2204，4108，0214，5503，5504，2203。对割胶成功的24 个蛋白质点进行胶内酶切后质谱鉴定，得到24 个蛋白点的肽指纹图谱。

采用Mascot 软件在NCBI 进行数据库搜索，当蛋白匹配度大于95%时认为具有显著性 （P<0.05）即具备可靠性。所得蛋白质点Mascot 检测结果如表4所示。经质谱鉴定，检测出的差异蛋白点主要有肌动蛋白、肌球蛋白及其相关蛋白，但出现多个蛋白点代表同一蛋白质的现象。这可能是由于蛋白多种翻译后修饰的结果[19]，仍需要进一步研究。

图4 鲢鱼肌原纤维蛋白降解过程中差异蛋白点Fig.4 Differential protein spots in the degradation of silver carp myofibrillar protein

表4 蛋白质点的肽指纹图谱Mascot 检索结果Table 4 Mascot search results of the PMF of protein spots

2.3 差异蛋白质的功能分类

2.3.1 差异蛋白质的细胞组成分类 表5列出的Level 9 级别的差异蛋白质的细胞组成分类，结果显示，蛋白质主要以骨架结构部分（cytoskeletal part）为主。收缩纤维部分（contractile fiber part）及肌原纤维（myofibril）各自包含1 个蛋白点，为点3504；中间丝骨架（intermediate filament cytoskeleton）包含2 个蛋白质，分别为点5504 及6407；肌动蛋白骨架（actin cytoskeleton）包含4 个蛋白点，分别为3504，5503，5506，6512；骨架结构部分（cytoskeletal part）包含6 个蛋白点，分别为3504，5504，6407，5503，5506 及6512。表明在降解过程中，主要是肌原纤维蛋白的骨架结构发生破坏。Ayala 等[20]发现鲷鱼在0 ℃贮藏期间肌原纤维蛋白降解速度非常快，其中主要是细胞骨架蛋白被降解。

表5 差异蛋白质细胞组成分类Table 5 Cellular component classification of identified proteins

2.3.2 差异蛋白质的分子功能分类 分析鲢鱼肌原纤维蛋白质组的功能情况，将差异蛋白质进行Level 8 级别上的基因本体的注释，被分为3 个类别。从表6得知，ATPase 活性功能 （ATPase activity）包含1 个蛋白点，为点3504；肌动活动功能（motor activity）包含3 个蛋白点，分别为：5503，5504，6512；腺嘌呤核苷酸结合功能 （adenyl ribonucleotide binding）包含4 个蛋白点，分别为点1012，3504，6512，1105。

2.3.3 差异蛋白质的生物过程分类 利用GO 的功能对鉴定出的差异蛋白质点进行Level 5 级别上的生物过程分类和鉴定，见表7所示。差异蛋白质可以被分为35 个生物途径，其中，包含一个蛋白质的生物过程有：肌动蛋白运动、肌肉系统过程、骨架结构、有机氮化合物分解过程、杂环化合物分解过程、细胞成分形态、细胞凋亡调节、含磷化合物代谢过程、有机环状化合物应激、细胞含氮化合物代谢过程、细胞器组装、有机磷酸酯代谢过程、蛋白亚基组成复合体过程、嘌呤化合物代谢过程、脂类应激、肌肉组织发育过程、芳香族化合物代谢过程、糖类衍生物代谢过程、糖基化合物分解过程、有机环状化合物分解过程、细胞分化过程、细胞过程的负调控、含碱基化合物代谢过程、金属离子应激过程、循环系统过程、激素应激过程、乙醇应激过程、细胞凋亡规划过程，共30 个生物过程，其包含的蛋白质点均为点3504。

信号传导过程包含1 个蛋白点0116；规范过程包含1 个蛋白点6512；微管发育过程包含3 个蛋白点2402，1410 及5302；胚胎发育过程包含4个蛋白点2402，1410，5302 及6512；组织形态形成过程和系统发育过程包含5 个蛋白点2402，1410，5302，4203 及3504；形态发育过程中的解刨学结构形成过程包含6 个蛋白点2402，1410，5302，4203，6512 及3504。结果表明，这些蛋白点在降解过程中可能参与多种生物途径，且1 个蛋白可能参与多个生物途径。赵巧灵[10]在金枪鱼冷藏过程中鉴定差异蛋白质中发现有5 种关于肌原纤维结构蛋白质，分别是肌球蛋白重链-1、肌球蛋白轻链-1、肌球蛋白轻链-3、α-肌动蛋白和β-肌动蛋白。

表6 差异蛋白质分子功能分类Table 6 Molecular function classification of identified proteins

2.4 差异蛋白点的生物信息学分析

肌动蛋白在体内一般以球形肌动蛋白（G-肌动蛋白）和纤维性肌动蛋白（F-肌动蛋白）两种形式存在，是构成细胞骨架和肌小节的主要蛋白质，主要参与肌肉收缩[21]。

肌动蛋白结构中结合位点较多，可与多种蛋白质相结合，以发挥不同的细胞功能。它与肌球蛋白结合，使肌球蛋白ATP 酶的活性变大，为肌肉的运动提供能量，其与肌球蛋白相互作用，促使肌肉运动[22]。

在本研究中，被鉴定为肌动蛋白及相关蛋白的蛋白点包括4 ℃组中的点0510，1410，3504，3413，1105，1005，0014 和6406，25 ℃组中的点2402，2304，5302 和4104。其中，4 ℃组中点0510，1410，3504，3413 出现下调，点1105，1005 和0015出现上调，而点6406 的丰度呈现先上升后下降的趋势；25 ℃组中点2402 和2304 出现下调，而点5302 和4104 的丰度呈现先上升后下降的趋势。表明在降解过程中，碱性蛋白酶破坏肌动蛋白，使其被分解为多个基团，而出现先上升后下降趋势的蛋白点仍需要进一步研究。

肌球蛋白在鱼肌肉中含量约50%，而且它与肉的热凝胶能力有着较为重要的关系[23]。肌球蛋白是一种大的不对称分子，具有一条α-螺旋组成的螺旋状颈部和2 个分子质量为500 ku，具有ATPase 活性的球形头部区域，总体而言，其包含2条重链（MHC）和4 条轻链（MLC）[24]。肌球蛋白具有两种轻链，一种是调节轻链，其在磷酸化作用和去磷酸化作用中有着重要作用，另一种是基本轻链，同时也被称为碱性轻链。肌球蛋白重链是骨骼肌粗肌丝的重要组成单位，其表达量高低影响肌纤维的组成和肌肉生长[25]。肌球蛋白重链包括3 个结构及功能不同的结构域：头部结构域的结构最保守，它具有与ATP、肌动蛋白结合的位点；结构域为α-螺旋的颈部，它通过与调节轻链亚基相结合来调节头部的活性；尾部结构域含有决定尾部是否与膜结合，还是与其它的尾部相结合的位点，由此它决定是否产生肌球蛋白二聚体或者肌球蛋白纤维。在本研究中，与肌球蛋白及相关蛋白质有关的蛋白点有4 ℃组中的0007 和6512，在降解过程中，点0007 的丰度出现下调趋势，而点6512 的丰度则呈现上升趋势。

表7 差异蛋白质生物过程分类Table 7 Biological process classification of identified proteins

同时，肌球蛋白重链可以被酶解为重酶解肌球蛋白和轻酶解肌球蛋白。重酶解肌球蛋白具有肌球蛋白全部的ATPase 活性[26]，轻酶解肌球蛋白则对细丝的形成有着重要作用[27]。在本研究中，质谱鉴定结果为轻酶解肌球蛋白相关蛋白质的蛋白点包括4 ℃组中的点5006 和25 ℃组中的点5503，其丰度均在酶解过程中呈现上升趋势，具体机制仍有待研究。

Hypothetical protein cypCar_00047572 （点0116）在降解过程中呈现上升趋势，根据后面的GO 功能注释得知，此蛋白点与信号传导有关；hypothetical protein cypCar_00035009（点6407）在降解过程中呈现先上升后下降的趋势，根据GO 功能注释，此蛋白是中间丝骨架及骨架结构部分的组成部分；hypothetical protein cyp-Car_00036471，partial（点5504）在降解过程中呈现上升趋势，根据GO 功能注释得知，此蛋白点同样是中间丝骨架及骨架结构部分的组成部分，同时其又与肌动活动功能有关；hypothetical protein cypCar_00048243（点4203）在降解过程中呈现上升趋势，依据GO 功能注释，此蛋白点参与组织形态形成过程、系统发育过程及形态发育过程中的解剖学结构形成过程。然而这4 个蛋白点相关研究较少，仍需进一步研究。

2.5 差异蛋白质代谢途径

目前，关于水产品蛋白质微生物降解机制研究较少，通过KEEG 代谢途径分析无法找到肌原纤维蛋白的降解途径。通过前文降解过程中生物信息学分析，可推测，在降解过程中，碱性蛋白酶将肌原纤维蛋白结构展开，破坏其骨架，使肌动球蛋白解体为肌动蛋白及肌球蛋白。随后，碱性蛋白酶主要作用于肌原纤维蛋白组分中的肌动蛋白及肌球蛋白，分别将肌动蛋白降解为肌动蛋白的多个肽段，将肌球蛋白降解为肌球蛋白重链和轻酶解肌球蛋白。

3 结论

在4 ℃和25 ℃条件下，随着碱性蛋白酶处理时间的增加，蛋白图谱中蛋白点的数量呈现先增加后减少的趋势。推测碱性蛋白酶降解肌原纤维蛋白的途径可能是首先破坏肌原纤维骨架结构，肌动球蛋白解体为肌动蛋白和肌球蛋白，随后，肌球蛋白及肌动蛋白进一步被分解为其它产物如肌球蛋白重链等。