紫山药抗性淀粉调节高脂血症金黄地鼠脂质代谢

李 涛，宋洪波，2，安凤平，2*，何 洪，黄 群，2

（1 福建农林大学食品科学学院 福州350002） 2 福建省特种淀粉品质科学与加工技术重点实验室 福州350002）

高脂饮食可导致血脂升高，严重时可引起一些危害人体健康的疾病，如动脉粥样硬化、冠心病和胰腺炎等，已成为现代社会人群主要的营养问题之一[1-2]。此外，长期食用高脂膳食还可导致体脂异常积累和肠道微生物群的不平衡[3]。通过饮食干预预防由高脂饮食引起的健康问题正成为研究的热点。

抗性淀粉在小肠中难以被酶解吸收，而在大肠中可被酵解，其通过上消化道进入大肠，经细菌发酵产生短链脂肪酸，调节肠道菌群[4]，降低血糖和胆固醇，抑制脂肪的吸收积累，改善慢性炎症[5-6]。盲肠是大肠的起始段，虽然盲肠、结肠是细菌最密集和多样的区域，且二者内容物中菌群结构具有相似性，但是优势菌群存在差异[7-8]。目前关于盲肠中菌群变化特征与改善因高脂饮食诱导高血脂和高血糖关系的研究少有报道。紫山药（Purple Dioscorea alata L）为多年生藤本植物薯蓣（Dioscorea alata L）的块茎，在我国南方地区广泛种植，淀粉约占生物总量的16%～20%[9]。

本研究以紫山药高抗性淀粉为原料，揭示紫山药高抗性淀粉对盲肠微生物的益生作用及其改善高血脂症效能，可为盲肠菌群及脂质代谢与健康的研究提供依据。

1 材料和设备

1.1 材料与试剂

紫山药（紫玉淮山），产自福建省三明市建宁县。普鲁兰酶（2 800 U/g）、高温α-淀粉酶（8 000 U/mL），美国Sigma 公司；淀粉葡糖苷酶（100 000 U/mL），上海麦克林生化科技有限公司；D-葡萄糖检测试剂盒，爱尔兰Megazyme 公司；血脂试剂盒，南京建成生物工程研究所；TIANamp Stool DNA kit 试剂盒，天根生化科技有限公司；柠檬酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠、无水乙醇均为国产分析纯。

基础饲料成分：碳水化合物72.3%、蛋白质14.9%、脂肪12.8%；高脂饲料成分：氢化椰子油5%，玉米油5%，胆固醇0.2%和基础饲料89.8%。饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司。

1.2 主要设备与仪器

DHG-9003A 型热风干燥箱，上海精宏试验设备有限公司；SYQ-DSX-280B 型高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；TDL-5-A 型低速离心机，上海安亭科学仪器厂；VERTEX70 型傅里叶红外光谱仪，德国布鲁克分析仪器公司；GA-3 型血糖仪，三诺生物传感股份有限公司；CFX96 型荧光定量PCR 仪，美国Bio-Rad 公司；PE300 型Illumina MiSeq 测序仪，美国Illumina 公司。

2 试验方法

2.1 紫山药抗性淀粉的制备

紫山药淀粉的制备见文献[9]。将50.0 g 紫山药淀粉 （干基），加至200 mL 磷酸缓冲溶液（0.2 mol/L，pH 5.0）中煮沸30 min，降温至58 ℃；加入普鲁兰酶（2 800 U/g）搅拌12 h；调节至7.0，120℃保温30 min，冷却至4 ℃贮藏24 h，反复2 次；将沉淀粉40 ℃干燥后，称取20.0 g 加入100 mL pH 6.0 乙酸钠缓冲溶液，升温至90 ℃，加入0.3 mL 高温α-淀粉酶（8 000 U/mL）保持1 h，冷却至60 ℃并用稀释的柠檬酸调节pH 至4.5，加入0.3 mL 淀粉葡糖苷酶（100 000 U/mL）保持1 h；以3 000×g 离心15 min，蒸馏水洗涤淀粉3 次，体积分数95%乙醇洗涤3 次，40 ℃干燥24 h，粉碎过100 目筛，得高抗性淀粉（HRS）。经检测，HRS 中的快速消化淀粉、缓慢消化淀粉和抗性淀粉的含量分别为11.4%，28.4%和60.2%。

2.2 FTIR 分析

傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析根据Wang等[10]的方法稍做修改。将干燥的HRS 样品与溴化钾以1∶100～1∶150 的比例进行混合，充分研磨。将研磨好的粉末倒入模具中抽真空压片，12 MPa 的压力下保持30 s，压至透明，在4 000～400 cm-1扫描范围内利用傅里叶变换红外光谱扫描仪观察。

2.3 动物模型建立

雄性金黄地鼠，SPF 级，6～8 周龄，体重90～110 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。适应性喂养1 周后，将32 只金黄地鼠随机分为4 组饲喂：正常对照组（NC）：基础饲料+等量生理盐水；模型组（MC）：高脂饲料+等量生理盐水；HRS 低剂量组（LR）：高脂饲料+0.5 g/100 g bw 高抗性淀粉；HRS 高剂量组（HR）：高脂饲料+1.5 g/100 g bw 高抗性淀粉。金黄地鼠自由采食、饮水，10 h/14 h 白昼交替喂养4 周。

2.4 盲肠内容物收集

在第2 和第4 个周末禁食12 h，各试验组分别宰杀3 只和5 只金黄地鼠，收集盲肠内容物包装后于-80 ℃冷冻。

2.5 血清指标测定和脏器变化

在第4 周末眼眶取血后处死，快速剥离肝脏、肾脏、脾脏、附睾和肾周的脂肪组织并称重；将血液收集在采血管中，于4 000 r/min、4 ℃离心15 min，血清分装在1.5 mL 离心管中，于-20 ℃保存备用；按照血脂测定试剂盒说明书测定甘油三脂（TG）、总胆固醇 （TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的浓度。

2.6 DNA 提取和16S rDNA 基因PCR 扩增

使用TIANamp Stool DNA kit 试剂盒从金黄地鼠盲肠内容物中提取DNA。以盲肠内容物中细菌基因组为模板，以520F 和802R 为上下游引物，扩增16S rDNA 的V4 区。其中，PCR 反应体系（50 μL）：10×Taq buffer 5 μL；d NTP 5 μL；上游引物515F（20 μmol/L）0.5 μL；下游引物806R（20 μmol/L）0.5 μL；Taq 酶0.5 μL；模板1 μL；dd H2O 37.5 μL。PCR 反应条件：94 ℃3 min；94 ℃45 s，50 ℃60 s，72 ℃90 s，35 个循环；72 ℃10 min[11]。

2.7 测序数据的生物信息分析

采用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制备测序文库，在Illumina Miseq测序仪上进行测序；将测序条带拼接，按照与参照序列≥97%的相似度聚类，建立OTU，并确定种系型。利用热图和分类组成分析（LEfSe 分析）分别研究金黄地鼠盲肠菌群丰度和分类组成的变化。

2.8 统计分析

所有检测一式3 份，采用DPS 8.0 软件包进行统计学分析。结果表示为：平均值±标准偏差。方差分析按5%显著性水平进行。

3 结果与讨论

3.1 傅里叶变换红外光谱

NS 和HRS 的红外光谱图如图1所示。在NS光谱中，3 438 和2 928 cm-1处的强吸收峰分别对应于O-H 和C-H 键伸缩振动。在1 082 和1 160 cm-1对应的是C-O 键伸缩振动；1 646 cm-1处吸收峰与淀粉内部的结晶水有关，是醛基的C=O 吸收峰[12]。这些吸收峰在HRS 中亦被观察到，但是3 438，2 928 和1 646 cm-1处的峰较弱，表明HRS中羟基和醛基含量降低[13]。NS 在927 cm-1处有D-吡喃葡萄糖的I 型吸收带，在709 cm-1处有D-吡喃葡萄糖的III 型吸收带，而HRS 均没有，说明原淀粉经处理后D-吡喃结构被破坏。

3.2 器官和脂肪组织质量

图2中显示了喂养4 周后4 组金黄地鼠器官质量和脂肪组织质量对比。与正常对照组相比，高脂饮食导致肝脏和肾脏质量、附睾和肾周脂肪质量显著增加，内脏器官的质量增加源自于脂肪的大量积累；然而，各组间脾脏质量无显著性差异（P>0.05），表明短时间内高脂或HRS 饮食不会明

图1 淀粉的傅里叶变换红外光谱分析Fig.1 Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）analysis of starches

3.3 血糖和血脂

金黄地鼠的血糖和血脂指标对比如表1。在第4 周结束时，与正常对照组相比，模型组的血糖显著增加（P<0.05）。这是因为高脂食物诱导的血糖升高与肝脏细胞的糖原异常增加有关，在脂肪代谢障碍情况下，肝脏中脂肪积聚减弱，从而减弱了葡萄糖转化为脂质，导致血糖升高[17]。然而，高剂量HRS 干预后血糖显著降低至正常水平（P<0.05）。这是因为抗性淀粉可降低代谢速度、调节胰岛素水平，使高脂饮食诱导的高血糖现象得到抑制[18]。

图2 4 周末金黄地鼠器官和脂肪组织质量Fig.2 Change in organs and adipose tissues weight of golden hamsters over the four week period

由表1还可以看出，与正常对照组相比，模型显影响金黄地鼠的免疫系统[14]。与正常对照组相比，高剂量HRS 显著降低了肝脏和肾脏质量，抑制了由高脂饮食诱导的脂肪组织扩张，附睾和肾周脂肪质量得到有效控制。此结果与Martinez 等[15]的报告一致，他们发现生马铃薯抗性淀粉可减少脂肪组织的形成。这是因为较高剂量抗性淀粉食物消化和吸收缓慢，有效减少了脂肪生成[16]。组中TC、TG 和LDL-C 水平显著升高，HDL-C 显著降低（P<0.05）；除HDL-C 浓度外，低剂量RS 组与模型组的血脂指标无显著差异（P<0.05）。与模型组相比，高剂量HRS 组的TC、TG 和LDL-C 含量显著降低，HDL-C 含量显著升高（P<0.05），表明高剂量HRS 饮食可使高脂血症明显减轻。相关研究证实，用玉米和高粱制备抗性淀粉亦能够降低血清胆固醇和血脂水平[19-20]。可能是因为抗性淀粉经肠道菌群发酵产生短链脂肪酸，抑制脂肪合成酶活性，调节血液与肝脏中胆固醇再分配，从而抑制胆固醇与甘油三脂的合成[21]。

表1 紫山药抗性淀粉对金黄地鼠血糖和血脂指标影响Table 1 Effect of purple yam resistant starch on the blood glucose and blood lipid parameters in golden hamsters

3.4 盲肠菌群变化

各试验组金黄地鼠盲肠菌群序列的OTU 数量曲线如图3a 所示。与第2 周相比，喂养4 周后正常对照组和高剂量HRS 组盲肠菌群OTU 数量明显增加，模型组和低剂量HRS 组OTU 数量有所减小；特别是与其它各组相比，高剂量HRS 组的OTU 数量最高。OTU 数量是菌群相对丰度分析中的一个重要参数[22]。由此可见，高剂量HRS 对增强金黄地鼠盲肠菌群相对丰度具有积极作用。

在门水平上，不同组盲肠细菌的相对丰度如图3b 所示。总体而言，盲肠细菌群落主要包括3个门，其中厚壁菌门（Firmicutes）占主导，其次为拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）。与第2 周相比，第4 周末模型组的拟杆菌数量显著减少，厚壁菌门增加，厚壁菌门与拟杆菌的比例增加，有研究表明肥胖小鼠的厚壁菌与拟杆菌的比例明显高于正常对照组[2，22]；而空白对照组和HRS 组拟杆菌门、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门 （Actinobacteria）和浮霉状菌门（Planctomycetes）相对丰度增大，而厚壁菌门的相对丰度减小，尤其以高剂量HRS 组更为明显，而且相对丰度亦增大；硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、软壁菌门（Tenericutes）、绿菌门（Chlorobi）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和蓝细菌（Cyanobacteria）等的丰度没有明显变化。由此可见，喂食HRS 饲料4 周后，高剂量HRS 导致拟杆菌门、变形菌门与厚壁菌门比例进一步增加。

在科水平上，盲肠细菌类群相对丰度如图3c所示。高剂量HRS 组盲肠菌群多样性较其它组高，而模型组最少。抗性淀粉在肠道发酵过程中产生许多有益代谢物，可能有助于促进有益菌繁殖并增加肠道微生物群多样性[23]。高剂量HRS 组的细菌科主要由丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、拟杆菌科S24-7 组、真杆菌科（Eubacteriaceae）、瘤胃球菌科 （Ruminococcaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）组成。虽然高、低剂量HRS 组细菌科的构成相似，但不同细菌的丰度存在差异。与2 周相比，HRS 干预4 周后，盲肠中代表性优势细菌[24-25]瘤胃球菌科、毛螺菌科和拟杆菌科S24-7组的丰度增加，而真杆菌科稳定。有研究表明，瘤胃球菌对抗性淀粉的降解起重要作用[26]，有利于能量释放[17]。作用机理有待进一步探索。

图3 金黄地鼠盲肠细菌群落的变化Fig.3 Variation of cecal microbiota in golden hamsters

3.5 盲肠菌群结构分析

一些主要细菌科水平的变化用热图表示 （图4a），以评价其对细菌门变化的贡献。与第2 周相比，用高脂饮食喂养4 周后金黄地鼠盲肠中拟杆菌门的相对丰度明显减小，厚壁菌丰度增大，而高剂量RS 组拟杆菌以及相对丰度增大，厚壁菌门丰度减小。有研究指出，肥胖人群中厚壁菌的比例较正常人群的显著增加，而拟杆菌门则低于正常人群[40]，这是因为拟杆菌门较其它微生物如厚壁菌门需要更广的碳水化合物底物范围[16]。高脂饮食可减少肠道中可用碳水化合物量，增加肠道氧应激状态及其自身的次级代谢物，从而破坏肠道微生物环境抑制益生菌的增殖[27-28]。因此，厚壁菌门丰度的减小和拟杆菌门、变形菌门丰度的增大，有效改善了高血脂症症状（见表1）。

图4 金黄地鼠盲肠菌群结构分析Fig.4 Structural analysis of cecal microbiota in golden hamsters

分类组成分析（LEfSe 分析）如图4b 所示。高、低剂量HRS 组喂养4 周与空白对照组、模型组喂养2 周时盲肠内容物中多个分类群存在显著差异。与其它组相比，其中低剂量HRS 干预4 周时拟杆菌的丰度高，高剂量HRS 干预组菌群主要为 瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）和梭菌属（Clostridia）。

抗性淀粉通过上消化道进入下消化道，由细菌发酵产生重要的代谢产物，如短链脂肪酸，从而改善肠道微生态环境[29-30]。因此，食用HRS 可调节肠道细菌构成，改善因高脂饮食导致盲肠菌群失衡，进而调节血脂水平。

4 结论

1）紫山药高抗性淀粉可有效减轻高脂血症金黄地鼠内脏的脂肪质量，降低血糖值；血液指标中TC、TG 和LDL-C 浓度显著降低，HDL-C 浓度增加。

2）高抗性淀粉干预4 周后，盲肠中厚壁菌门的数量减少，拟杆菌门和变形菌门的数量增加；代表性优势细菌瘤胃球菌科、毛螺菌科、拟杆菌科S24-7 组和梭菌属的丰度增加，有效改善了因高脂饮食导致的盲肠菌群失衡。