利福昔明乳房注入剂(干乳期)对奶牛的安全性研究

王宏磊，陈孝杰，程雪娇，焦晓军，王 猛，徐 飞，陈 晨,刘义明*，李秀波*

(1.中国农业科学院饲料研究所，国家饲料药物基准实验室，北京 100081；2.天津中升挑战生物科技有限公司，天津 300380；3.佛山南海东方澳龙制药有限公司，广东佛山 528234)

奶牛乳房炎是由于乳房无法完全抵御致病微生物的入侵和增殖而造成的乳房组织及乳头发炎的一种常见疾病，其主要特点是乳汁发生理化性质及细菌学变化，乳腺组织发生病理学变化。在临床上将乳房炎分为隐性乳房炎和临床型乳房炎。乳房炎不仅造成奶牛产奶量下降、影响牛奶品质，也使奶牛过早淘汰，给奶牛养殖业带来巨大经济损失，严重困扰着奶牛养殖业的健康发展[1-3]。尽管对奶牛乳房炎进行了大量研究，但目前该疾病仍然是困扰奶牛养殖业的一大顽疾，无法根除。据报道，全球奶牛30%患有乳房炎，隐性乳房炎的患病率更是达50%以上[4]。病原菌的感染是引起奶牛乳房炎的主要因素，常见致病菌有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌，这3 种细菌引起的乳房炎占总发病率的90 %以上[5-7]。由于奶牛干乳期乳腺的抵抗力低，病原菌容易乘虚而入，干乳期是奶牛乳房炎的高发期，尤其是隐性乳房炎，难以发现，给泌乳期造成严重的隐患。因此,在即将进入干乳期时给奶牛用药，能有效地预防和治疗干乳期乳房炎[8-9]。利福昔明是利福霉素类衍生物，为非氨基糖苷类半合成抗菌药[10]。其作用机制为抑制细菌多聚酶，阻断RNA的转录过程，进而抑制细菌蛋白质的合成[11]。其抗菌活性强，抗菌谱广，对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌都有良好的效果[12]。它最初是用来防治人体局部细菌感染的药物，并先后在意大利，墨西哥，西班牙和美国上市。利福昔明在体内不易吸收，意大利Fatro公司开发了动物用乳房注入剂、子宫注入剂和喷雾剂，用于治疗奶牛干乳期乳房炎、子宫炎症及皮肤感染。目前，利福昔明乳房注入剂(商品名Fatroximin或Fatrox)已在欧洲得到广泛的应用[13]。国内用于干乳期治疗乳房炎的药物相对较少，为提高干乳期奶牛乳房炎的防治效果，降低养殖成本，提高养殖效益，天津市中升挑战生物科技有限公司成功研制了利福昔明乳房注入剂(干乳期)，为干乳期奶牛乳房炎的预防和治疗提供一种新的选择。本研究考察了利福昔明乳房注入剂(干乳期)对奶牛的安全性，以期为该制剂的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 受试药物 利福昔明乳房注入剂(干乳期)，包装规格:5 mL：0.1 g，批号：120810；由天津市中升挑战生物科技有限公司提供；推荐用药方法：干乳期奶牛每头牛每个乳区给药1支。

1.2 试验动物 参考FDA相关指导原则，实验动物为健康泌乳期奶牛12头，产奶量在20～35 kg/d之间。

1.3 给药 12头泌乳期奶牛四个乳区分别注入利福昔明乳房注入剂(干乳期)一支，给药1次。奶牛挤奶后，先用消毒毛巾清洁各乳区，再用消毒药液浸泡乳头约30秒，然后进行乳头内灌注给药。灌注时将含药推注管头插入乳头，轻轻推压活塞，将药物缓缓注入乳池内，随后轻轻按摩相应乳区，使药物均匀分布。

1.4 乳中体细胞数检测 给药前1 d、给药当天(第0天)和给药后第12小时、3、5、7、10 天，四个乳区分别采集奶样，每次挤奶前弃掉前3把奶，用50 mL灭菌聚丙烯离心管采集奶样，直接使用体细胞计数仪进行牛奶中体细胞数(somatic cell count，SCC)检测。

1.5 日产奶量统计 给药前1 d、给药当天和给药后第1、3、5、7、10 天统计奶牛的日产奶量。每天早、中、晚分别对每头奶牛挤奶，每头奶牛每次挤奶汇入专用收集桶中，称重并记录，统计每头奶牛每天3次挤奶总产奶量(即日产奶量)，计算12头奶牛的平均日产奶量。

1.6 病原菌分离鉴定 分别在给药前0日和给药后第10日各采集奶样1次进行细菌学检查。用多种选择性培养基培养分离病原菌。将奶样接种至选择性培养基分离病原菌，主要分离金黄色葡萄球菌、链球菌(停乳链球菌、乳房链球菌)、大肠杆菌。分离菌株经纯化培养后，依据菌落形态、染色特征、生化特点鉴定其种类。

1.7 直肠温度检查 给药前1天、给药当天和给药后第12 小时、3、5、7、10 天，测量试验奶牛的直肠温度，观察试验奶牛在给药前后体温是否有明显变化。

1.8 临床症状观察 整个试验过程中，每天观察各试验奶牛的临床症状并进行记录。一旦出现临床症状立即采取相应措施。

2 结果与分析

2.1 体细胞计数 由表1数据可知，12头奶牛给药前不同乳区体细胞检测结果与给药后各时间点奶样中体细胞数未见显著性差异(P>0.05)。

2.2 产奶量 由表2可知，12头奶牛在给予利福昔明乳房注入剂(干乳期)后，与给药前相比，各时间点产奶量无显著变化(P>0.05)。

2.3 细菌分离鉴定 在给药前0 d采集的奶样中，分离的大肠杆菌、链球菌和葡萄球菌分别为7株、6株和9株，给药后第10日，未检测到大肠杆菌和葡萄球菌，仅检测到1株链球菌(表3)。

表1 12头奶牛不同乳区给药前后奶样中的体细胞数(万/mL)统计

表2 12头奶牛各时间点的产奶量(kg/d)

2.4 奶牛的直肠温度 由表4可知，所有奶牛在给药前和给药后不同时间点的直肠温度均在奶牛的正常温度范围内，说明按推荐剂量单次给药对奶牛的体温无显著影响。

2.5 临床症状观察 12头奶牛四个乳区分别单剂量给予利福昔明乳房注入剂(干乳期)，在整个试验期间，给药乳区未出现红、肿、热、痛等临床症状。

3 讨论与结论

奶牛乳房炎是奶牛养殖业中非常高发的一种疾病，能够造成牛奶质量的急剧下降，奶牛过早的被淘汰，及治疗费用的增加，给奶牛养殖业造成了巨大的经济损失[14-15]。兽医临床上导致奶牛乳房炎的致病菌种类繁多，但主要的致病菌有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌[16-18]。利福昔明是半合成利福霉素衍生物，具有组织吸收水平低的特点，且对厌氧菌具有良好的杀灭效果，适合局部用药，制成乳房注入剂直接注入乳房,能很好的发挥其杀菌作用[19-20]。关于利福昔明的安全性，国内外均有一些报道，据Borelli等[21]的报道，用大鼠和小鼠做单剂量口服急性毒性试验，结果表明利福昔明对大鼠的LD50大于2000 mg/kg·bw，小鼠的LD50为2000 mg/kg·bw。Bertoli等[22-23]的研究表明，利福昔明以50、100 mg/kg·bw剂量口服无致畸作用。据美国FDA报道[24]，口服利福昔明100 mg/kg·bw对雄性和雌性大鼠的生育能力、胎儿产后发育及下一代生殖性能均无不良作用。任淑萍等[25]报道，大鼠每天口服利福昔明25、50、100 mg/kg，连续180 d，除雌鼠血清胆固醇呈剂量相关性增加外，无致突变、致畸及其他毒性作用。史同瑞等[26]对利福昔明混悬乳剂在豚鼠、家兔和羊上进行了安全性研究，致敏性试验显示豚鼠均未出现过敏性反应，皮肤刺激性试验显示家兔皮肤未见异常变化，黏膜刺激性试验中仅有1只家兔的阴道黏膜出现轻微的充血现象，羊的乳腺刺激性试验显示羊乳房未见异常症状, 以上结果表明利福昔明混悬乳剂是一种安全性良好的制剂。为了评价干乳期利福昔明乳房注入剂在奶牛临床上应用的安全性，王建等[27]对干乳期利福昔明乳房注入剂进行了豚鼠主动皮肤过敏性试验、家兔的皮肤刺激性试验和阴道刺激性试验。在豚鼠主动皮肤过敏性试验中，给药组动物皮肤未见红斑与水肿，在家兔的皮肤刺激性试验和阴道刺激性试验中，给予利福昔明乳房注入剂的试验组和生理盐水的对照组，两组给药部位的皮肤都没有出现红斑和水肿,在家兔的阴道刺激试验中，试验组和对照组的阴道黏膜没有出现明显的白细胞浸润、充血和水肿现象,以上结果表明利福昔明乳房注入剂对豚鼠的皮肤不产生明显的皮肤过敏性反应，对家兔的皮肤和阴道无刺激性。徐飞等[28]对利福昔明子宫注入剂在家兔阴道黏膜刺激性研究中也得到了类似的结论。本实验中奶牛给药前后不同乳区奶中体细胞数未见明显变化，产奶量在给药前后也未见显著变化，12头奶牛在给药前和给药后不同时间点的直肠温度均在奶牛的正常温度范围内，12头奶牛四个乳区在整个试验期间，给药乳区未出现红、肿、热、痛等临床症状。结合前面王建等对干乳期利福昔明乳房注入剂进行的豚鼠主动皮肤过敏性试验、家兔的皮肤刺激性试验和阴道刺激性试验结果，说明利福昔明乳房注入剂(干乳期)对奶牛无任何不良反应，安全性高。郭旭[29]对利福昔明乳房注入剂对干奶期奶牛临床性乳房炎预防效果的实验表明：高、中、低剂量的利福昔明乳房注入剂均能显著的降低乳中金黄色葡萄球菌、链球菌及大肠杆菌的数量，本试验在给予利福昔明乳房注入剂(干乳期)后也得到了类似的结论，说明利福昔明能够杀死临床上导致奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌、链球菌及大肠杆菌。

表3 实验奶牛各时间点不同乳区奶中细菌分离情况

表4 12头奶牛不同时间点的直肠温度(℃)

12头奶牛四个乳区分别单次注入利福昔明乳房注入剂(干乳期 5 mL：0.1 g)，不同时间点体温及奶样中体细胞数与给药前相比未见明显变化，奶牛的产奶量也未见显著变化，奶牛给药乳区未出现红、肿、热、痛等临床乳房炎症状，与给药前相比给药后细菌检出数有所降低。上述结果表明奶牛按推荐剂量单次给予利福昔明乳房注入剂(干乳期)对奶牛无任何不良反应，安全性较高。