QuEChERS-dSPE-UPLC-MS/MS筛查中药材地龙中41种兽药残留

许晓辉，王小乔*，党子龙，朱仁愿，张虹艳，李晨曦，潘秀丽，李 赟

(1.兰州市食品药品检验检测研究院，兰州 730050; 2. 兰州大学第一医院药剂科，兰州 730000)

中药材分为植物源性中药材和动物源性中药材，动物源性中药材是指动物整体、器官、生理或病理产物等供药用的部分。《中国药典》2020年版收载了55种动物源性中药材，常见的有麝香、牛黄、地龙、海螵蛸、鹿角等[1-3]。然而，多数动物源性中药材大多数是以农户为单位人工养殖，在养殖过程中，缺乏对中药材外源性风险因子的认识，使用抗菌剂、抗生素和激素等兽药用于动物疾病防治、促进生长发育和提高饲料转化率。不合理使用兽药使药物在动物体内难以排泄，逐渐积累，患者通过服用中药材致使兽药转移到体内，对人体器官造成危害，严重威胁到身体健康和生命安全。目前，动物源性产品兽药残留已成为全球关注的焦点，为保护公众健康，大多数国家和地区对动物源性产品中兽药残留进行监管，并发布了相关法规制度。我国农业农村部、国家卫生健康委员会和国家市场监督管理总局在2019年联合发布了《GB 31650-2019 食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》[4]，该标准规定了动物源性食品中兽药残留的最大限值，但不涉及动物源性中药材；US FDA于2015年6月通过兽药饲料指令颁布了管控微生物药物使用的法规[5]；欧盟颁布了法规2014/0247(COD)，旨在达成影响评估所确定的目标，并解决抗生素耐药性带来的公共健康风险问题[6]。从国家监管部门对动物源性食品中兽药残留的市场监督抽检结果来看，兽药残留仍是影响动物源性食品质量安全的重要风险因子[7]，因此，对于与动物源性食品来源相似的动物源性中药材，同样存在兽药残留问题。近年来，多类别多残留分析方法因为可以扩大检测范围并提高实验室效率而在检测中越来越受青睐[8-10]，因此，本文建立了一种超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法测定地龙中多类别多组分兽药残留的方法，根据化合物质谱响应、峰型以及加标回收率，淘汰不出峰、响应低及加标回收率不理想的兽药，最终筛选出适合本方法良好测定的7大类41种兽药，测定项目涉及到磺胺类、喹诺酮类、硝基咪唑类、抗病毒类、糖皮质激素类、非甾体抗炎类和镇静安眠类。

1 材料与方法

1.1 仪器 1290-6460超高效液相色谱-质谱联用仪：配有电喷雾离子源(美国安捷伦有限公司)；分析天平：感量0.1 mg和0.01 g(梅特勒)；真空泵(天津市津腾实验设备有限公司)；移液器：20 μL、100 μL、1 mL(德国Eppendorf公司)；涡旋混合器(美国Scientific)；离心机(德国Eppendorf公司)；超声波清洗器(宁波新芝有限公司)；容量瓶(天玻仪器有限公司)。

1.2 试剂 超纯水(美国Millipore公司)；乙腈(色谱纯，德国Merck公司)，甲酸、乙酸铵(色谱纯，东京化成工业株式会社)；dSPE EMR-Lipid净化管(美国安捷伦公司)；氯化钠(国药集团化学试剂有限公司); 硫酸钠(国药集团化学试剂有限公司)；乙二胺四乙酸二钠(国药集团化学试剂有限公司)；磷酸氢二钠(国药集团化学试剂有限公司)；柠檬酸(国药集团化学试剂有限公司)。对照品，恩诺沙星、地美硝唑、磺胺甲恶唑、磺胺氯哒嗪、磺胺喹沙啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、金刚烷胺均购于Dr.Ehrenstorfer GmbH，环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、地塞米松、可的松、曲安奈德、氟米松、甲硝唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、保泰松、吲哚美辛、吡罗昔康、氨基比林、三唑仑、硝西泮、劳拉西泮、马来酸咪达唑仑、阿普唑仑、氯硝西泮、艾司唑仑、奥沙西泮、地西泮均购自中国食品药品检定研究院，洛硝哒唑、羟基甲硝唑、羟甲基甲硝咪唑购自WITEGA，沙拉沙星、磺胺间甲氧嘧啶均购自Bepure，金刚乙胺购自TRC，具体信息见表1。供试样品购买于中药材市场和药店。

表1 对照品信息

1.3 溶液制备

1.3.1 EDTA缓冲液制备 柠檬酸8.4 g，磷酸氢二钠7.1 g，乙二胺四乙酸二钠 19.5 g，溶于650 mL水中，超声溶解，即得。

1.3.2 对照溶液制备 标准储备溶液：精密称取41种兽药残留对照品10.0 mg，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解，并定容至刻度，配制成浓度为 1 mg/mL的储备液，置 4 ℃冷藏备用。混合标准中间溶液：分别准确吸取上述标准储备溶液0.025 mL至25 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释，并定容至刻度，配制成浓度为 1 μg/mL的混合标准中间液，置 4 ℃冷藏备用。混合标准使用溶液：准确移取上述混合标准中间溶液1.00 mL置于10 mL棕色容量瓶，用乙腈稀释，并定容至刻度，配制成浓度为 100 ng/mL的混合标准使用溶液。

1.3.3 阴性样品溶液的制备 取空白样品按照“1.4.1供试样品前处理方法”步骤同法制成空白基质样品溶液。

1.4 实验方法

1.4.1 供试样品前处理方法 提取：准确称取干燥的供试样品1.00 g于50 mL离心管中，加入3 mL EDTA缓冲液和陶瓷均质子，涡旋1 min，准确加入10 mL乙腈，涡旋1 min，超声提取5 min，加入1 g 氯化钠和4 g 硫酸钠，充分涡旋2 min，5000 r/min离心10 min，取上清液待净化。净化：准确吸取提取步骤所得上清液2.00 mL于 dSPE EMR-Lipid净化管中，涡旋1 min，5 000 r/min离心10 min，取上层清液过0.22 μm滤膜至进样瓶中，上液质联用仪测定。

1.4.2 色谱条件 色谱柱：ACQUITY BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：2 μL；流动相：A为含0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸铵的水溶液，B为含0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序

1.4.3 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，动态多反应监测(d-MRM)，雾化气N2，干燥气流速8 L/min，喷雾电压500 V，气流温度325 ℃，毛细管电压4000V，鞘气流速12 L/min，鞘气温度350 ℃；质谱条件见表3。

表3 41种兽药的质谱参数

1.5 数据处理 采用 Agilent MassHunter 工作站软件进行数据采集和分析，采用Excel进行数据统计与计算。

2 结果与分析

2.1 前处理条件选择 本实验考察的兽药包括亲水性和疏水性药物，酸性、中性和碱性药物，这些药物在适宜的浓度大部分能够在甲醇和乙腈中溶解，另一方面，流动相的有机相一般都是甲醇和乙腈，考虑到乙腈为中等极性溶剂，与大多数被测化合物极性接近，且乙腈能使蛋白质变性沉淀，因此选择乙腈作为提取溶剂。QuEChERS萃取盐包，内含 4 g 硫酸钠和1 g 氯化钠，通过盐析使样品中蛋白质沉淀并能去除极性干扰物。dSPE EMR-Lipid 选择性去除高脂肪基质中主要脂类组分，能够降低基质效应以增强质谱响应，同时有助于延长色谱柱使用寿命，同时无需活化、清洗和洗脱等传统SPE步骤，简化了净化流程，节约了时间和成本。因此本实验选择使用QuEChERS萃取盐包提取，dSPE EMR-Lipid 净化。

2.2 色谱质谱条件优化

2.2.1 色谱条件优化 本实验被分析的兽药之间化学性质各异、极性不一，因此，选择了适用于各种分析物通用的ACQUITY BEH C18超高效色谱柱。正离子模式下，在流动相中添加甲酸能够提高目标化合物的离子化效率，添加乙酸铵能够稳定水相和改善峰型，因此试验将乙腈、甲醇、甲酸、乙酸铵、水溶液进行组合，考察分离效果和灵敏度，选择最佳流动相体系。结果表明，在水相中加入0.1%甲酸和2 mmol/L乙酸铵可以显著改善峰型、提高灵敏度，在有机相中加入0.1%甲酸可以稳定保留时间，提高重复性。最终本实验采用含0.1%甲酸-2 mmol乙酸铵的水溶液与含0.1%甲酸的乙腈溶液作为流动相。

2.2.2 质谱条件优化 由于被分析兽药种类众多，采用MRM采集模式，受循环时间限，有些兽药响应低，因此，本研究选择将检测兽药分别配制成单个标准溶液，直接注入质谱仪，在正离子模式下，进行Scan扫描，确定母离子，后进行SIM扫描，选取丰度比最高且相对稳定的2个碎片离子分别作为定性离子和定量离子，然后利用MassHunter采集软件，以手动和自动两种方式同时优化定性和定量离子的碰撞能量、裂解电压等参数，建立MRM方法，为了建立d-MRM方法，首先在MRM方法下分析混合标样，得到混合标样数据文件，将该采集数据文件从安捷伦的MassHunter质谱采集工作站软件导入自动生成d-MRM方法，生成的d-MRM方法包含化合物名称、MRM离子对、碎裂电压、碰撞能量、动态MRM的保留时间和保留时间增量窗口，对于软件不能自动识别保留时间及保留时间增量窗口的化合物，在安捷伦定性软件通过提取化合物的离子对手动识别。

2.3 基质效应 基质效应是基质中除目标物以外的其他成分对目标物分析的影响。由于其成分与目标组分在离子化过程中存在竞争，改变了目标物的电离效率，使目标物的离子响应强度降低或增强，从而影响分析结果的准确性。本文通过考察空白样品基质中标准溶液的信号强度与纯溶剂中相同浓度标准溶液信号强度的比值来评价基质效应。结果显示，大部分兽药存在不同程度的基质效应，其中氨基比林、保泰松、羟基甲硝唑、氯硝西泮、诺氟沙星、洛美沙星、硝西泮存在较强的基质抑制效应，检测响应信号比较弱，而浓度为200 ng/mL的四环素、土霉素、金霉素、强力霉素样品基质溶液在质谱上几乎没有响应。

2.4 41种兽药的总离子流图 以d-MRM 模式测定41种兽药的定性和定量离子对色谱图，共有82个离子监测通道。图1是浓度为30 ng/mL的混合标准品的总离子流图，各个化合物峰形对称，响应良好，定量准确可靠。

图1 41种兽药标准品MRM总离子流图

2.5 线性关系、检出限、定量限 取混合标准使用溶液用空白样品基质溶液稀释配制成标准曲线点溶液，外标法定量，以X轴为浓度，Y轴为峰面积的响应值，得到各个兽药的线性回归方程，用于计算实际样品中待测物的浓度。取阴性样品，混合标准使用溶液通过最小添加量，按“1.4.1”项下供试样品前处理方法同法处理后上机进样测试，以3 倍信噪比计算各个被分析兽药的检出限(LOD)，以10倍信噪比计算各个被分析兽药的定量限(LOQ)。41种兽药的线性关系、检出限、定量限见表4。结果显示，41种兽药在各自范围内线性关系良好(R2>0.9917)，检出限范围为0.1000～3.105 μg/kg，定量限范围为0.3148～7.532 μg/kg。

表4 41种兽药的线性关系、检出限、定量限、回收率及精密度(n=3)

2.6 回收率及精密度考察 在空白地龙样品中分别添加混合标准中间溶液，低、中、高3个加标量分别为30.0、80.0、200.0 μg/kg，每个添加水平平行制备3份样，每份样重复测定3次，经提取净化后进行测定，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。结果显示，41种兽药的回收率为62.8% ～ 112.3%，精密度为1.1% ～ 8.9%。结果表明，该方法的准确度良好，符合定量检测要求。

2.7 样品的测定 为验证方法的可行性，将市售的10批地龙样品作为测试样品，应用该方法测定样品中7大类41种兽药残留，均未检出上述被分析目标化合物。

3 讨论与结论

动物源性中药材富含蛋白质和脂肪，测定兽药残留时，蛋白质和脂肪去除不干净或不彻底会产生基质效应，甚至会堵塞色谱柱，因此，前处理方法的选择是此类样品测试的关键。同时，动物在养殖整个生命周期中，不仅是动物出现病患违规使用兽药，而是将兽药作为动物产品违法获取经济利益的促进剂，使用兽药时多是一种药物产生耐药性后，便换成另一种，甚至多种药物同时使用，因此，兽药残留检测只测定一类药物有可能漏检，达不到全面评价动物源性中药质量安全的目的。目前， 一针进样同时测定多兽药残留是当前一个研究热点，这样可以节约成本、提高效率。本文采用QuEChERS、dSPE相结合的提取净化方法，建立了超高效液相色谱串联质谱法同时测定中药材地龙中7大类41种兽药残留的方法。以仪器方法为基础，结合地龙样品基质的特点，从提取方法、净化技术、色谱质谱条件等多个方面进行研究和优化，对建立的方法进行了方法学考察，结果表明，该方法各项指标均能满足分析检测的要求，与目前报道的文献和国家标准方法相比，该方法简化了复杂的前处理，实现了多类别多组分兽药残留同时测定，提高了检测效率，对动物源性中药材中多类别多组分兽药残留分析监测、快速筛查具有参考意义。