微载体悬浮培养ST细胞增殖猪瘟兔化弱毒的工艺研究

漆世华，秦红刚，韩 兴，李晶梅，熊 亮，石宝兰，谢红玲

(国药集团动物保健股份有限公司，武汉 430075)

猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的一种高度接触性传染病，对全世界的养猪业构成巨大威胁。不同年龄、性别和品种的猪均能感染，死亡率高达80%～90%。世界动物卫生组织将其列为必须通报的动物疫病之一，我国将其列为一类动物传染病[1]。猪瘟兔化弱毒疫苗是国际上公认的、安全有效的预防猪瘟的弱毒疫苗，也是在我国应用最广泛的猪瘟疫苗。该疫苗推出至今其生产工艺经历了升级换代过程，从组织毒疫苗、原代细胞毒疫苗到传代细胞毒疫苗等[2]。目前，传代细胞苗主要采用转瓶培养工艺，每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶细胞的质量、病毒含量都有差异，导致疫苗批间差异大，而且操作劳动强度大，生产效率低，有必要尽早转型为生产规模更大、集约程度更高的生物反应器培养工艺。

1967年Wezel[3]首先应用微载体系统培养贴壁依赖性细胞，此后这一技术得到迅速发展。生物反应器微载体悬浮培养系统由于具有较大表面积、细胞产量高、培养环境便于检测和控制等优点，已应用于狂犬病、脊髓灰质炎等疫苗[4-5]的生产。本研究以ST细胞为宿主细胞，采用微载体细胞悬浮培养技术进行猪瘟抗原的培养工艺进行了研究，为进一步利用生物反应器工业化大规模生产猪瘟疫苗提供基础性数据。

1 材料和方法

1.1 细胞、病毒和培养基 ST细胞、猪瘟兔化弱毒(简称“猪瘟病毒”)为国药集团动物保健股份有限公司保存；MEM、DMEM/F12、DMEM培养基为Hyclone公司产品；新生牛血清为内蒙古金源康公司产品。

1.2 微载体 cytodex1，GE公司产品。

1.3 主要仪器设备 NBS BioFlo310型生物反应器,培养体积10 L,购于NBS公司；一控四平行生物反应器，培养体积2 L，50 L生物反应器，购于广州齐志生物工程设备有限公司。

1.4 抗体 猪瘟单抗为JBT公司产品；羊抗鼠IgG-FITC为Thermo公司产品。

1.5 细胞悬液的准备 从液氮罐中取出冻存的ST细胞，复苏后在T25方瓶中静止培养，待细胞长满后，用0.25%胰酶消化分散细胞，按1∶4～1∶5的比例传代，如此连续扩繁细胞至所需数量，用0.25%胰酶消化分散细胞为ST细胞悬液，用于后续实验。

1.6 细胞最佳接种密度的确定 按照3 g/L的使用浓度称取cytodex1微载体，加入PBS水化8 h，121 ℃ 30 min高压灭菌。用DMEM/F12培养基置换掉PBS，补充新生牛血清至终浓度10%，加入到2 L生物反应器。分别以每个cytodex1微载体5、15、30个细胞的密度接种ST细胞悬液，进行生物反应器悬浮培养。生物反应培养参数设定为：搅拌速度50 r/min、pH7.2、溶氧50%、温度37 ℃。每天取样观察细胞的生长情况，计数细胞的密度，绘制细胞的生长曲线，以确定ST细胞的最佳接种密度。

1.7 细胞消化放大工艺参数的确定 待2 L生物反应器细胞的密度达到2.0×106/mL，将长满细胞的微载体收集到细胞消化瓶中。用pH7.20.01 mol/L的PBS洗涤细胞2次。每克微载体加入100 mL 37 ℃预热的0.25%胰酶消化液进行消化，并于消化后3 min、6 min、9 min、12 min取样观察细胞分散、变圆的情况。待细胞变圆但尚未与微载体脱离时，排出细胞消化瓶中的胰酶溶液，加入含10%新生牛血清的DMEM/F12培养基。震动细胞消化瓶，使细胞充分分散、脱离微载体，成为细胞悬液和微载体的混合物。将混合物接种到10 L生物反应器，每日取样确定细胞生长情况。

1.8 病毒增殖最佳培养基的确定 采用3 g/L微载体，每个cytodex1微载体15个细胞的密度接种ST细胞悬液，分别用含10%新生牛血清的DMEM、MEM和DMEM/F12培养基进行ST细胞悬浮培养，待细胞密度达到1.5×106/mL时，分别更换为含2%新生牛血清的DMEM、MEM和DMEM/F12培养基的病毒维持液，按照0.05 MOI接种猪瘟病毒，培养4 d，进行病毒第一次收获，以后每隔3 d收获并更换相应的病毒维持液，共收获6次。测定各收次猪瘟病毒的细胞半数感染量[6]，判定病毒增殖的最佳培养基。

1.9 病毒最佳接毒量的确定 采用3 g/L微载体和DMEM/F12培养基，每个cytodex1微载体15个细胞的密度接种ST细胞悬液，进行ST细胞悬浮培养，待细胞密度达到1.5×106/mL时，分别按照0.01、0.05、0.15MOI接种猪瘟病毒，培养4 d，进行病毒第一次收获，以后每隔3 d收获换液一次，共收获6次。测定各收次猪瘟病毒的细胞半数感染量[6]，确定病毒增殖的最佳接毒量。

1.10 病毒最佳培养条件的验证和稳定性研究 用1.6项确定细胞最佳接种密度、1.8项确定的细胞最佳培养基，在10 L生物反应器中培养ST细胞，待细胞长满微载体后，按1.7项确定的消化工艺参数将ST细胞消化放大至50 L生物反应器中，按1.9项确定的接毒量接种猪瘟病毒，培养4 d，进行病毒第一次收获，以后每隔3 d收获并更换相应的病毒维持液，共收获6次。取样检测猪瘟病毒含量[6]，并选取部分样品测定家兔感染量(RID)。将本工艺再重复验证2次。

2 结果与分析

2.1 细胞最佳接种密度的确定 将ST细胞分别以每个cytodex1微载体5、15、30个细胞的密度接种，进行生物反应器悬浮培养，发现在各接种密度的细胞在接种后3 h，95%细胞贴附上微载体，并开始伸展(图1)。每个cytodex1微载体接种15个细胞，在培养第4天细胞密度达2.4×106/mL(图2)，细胞状态稳定，维持时间长；每个cytodex1微载体接种5个细胞，培养第6天细胞密度才能达到高峰，由于有20%的空球，细胞密度也相对较低；每个cytodex1微载体接种30个细胞培养3 d细胞密度即达高峰，但细胞老化快，部分提前脱落。因此确定细胞的最佳接种密度每个cytodex1微载体接种15个细胞。

图1 细胞在微载体上的生长情况

图2 不同细胞密度接种细胞增殖曲线

2.2 细胞消化放大工艺参数的确定 采用细胞消化瓶，消化6 min，细胞完全分散(图3)，将2 L生物反应器消化分散的细胞悬液接种到10 L生物反应器，24 h 95%以上的细胞贴于微载体上，培养4 d，细胞密度可达2.8×106/mL，表明此消化放大参数合适、操作可行。

2.3 病毒增殖最佳培养基的确定 分别采用DMEM、MEM和DMEM/F12三种培养基进行猪瘟病毒培养，确定培养基对病毒增殖的影响，培养4 d(1收)细胞生长状况良好，形成致密的单层，第2收细胞更加致密，但从第3收开始，DMEM和MEM培养基培养的细胞逐渐有老化脱落的细胞，至第4收细胞脱落明显，出现约30%的微载体空球，后续死亡细胞增多，pH升高，耗氧量降低，未完成5收、6收；DMEM/F12培养的细胞全程均维持较好的状态，收获的抗原病毒含量也能达到较高的水平(表1)。因此确定病毒增殖最佳培养基为DMEM/F12。

A:胰酶消化前；B:胰酶消化6 min振摇分散后；C：放大培养24 h

表1 不同培养基对猪瘟病毒增殖的影响

2.4 病毒最佳接毒量的确定 0.01、0.05、0.15 MOI三个接种量接种猪瘟病毒，取样检测猪瘟病毒含量(图4)。0.05 MOI和0.15 MOI接毒，收获的抗原病毒含量相当，可以达到7.5 lgTCID50/mL，考虑到0.05 MOI用毒量较少，生产中可以节约种毒，确定最佳接毒量为0.05 MOI。

图4 不同接毒量对病毒增殖的影响

2.5 病毒最佳培养条件的验证和稳定性研究 采用优化的工艺参数，即cytodex1微载体浓度为3 g/L，每个cytodex1微载体15个细胞的密度接种ST细胞悬液于10 L生物反应器，采用DMED/F12培养基进行培养，待细胞密度达到2.0×106/mL，按上述确定的消化工艺参数将ST细胞消化放大至50 L生物反应器中，培养3 d，细胞密度达到1.5×106/mL，并接种猪瘟病毒。先后培养3批，验证工艺条件的可靠性和稳定性。3批病毒增殖差异不明显(图5)，从第2收开始，病毒的含量不低于7.0 lgTCID50/mL，最高可达7.6 lgTCID50/mL；选取了第一批的1～4收样品进行了兔体感染量的测定，2～4收样品均不低于400万RID/mL，说明确定的工艺参数使用效果好且稳定。

图5 工艺稳定性验证

3 讨论与结论

微载体培养具有较高的比表面积，培养条件可控等显著优点，悬浮培养工艺已经成为当前生物制品研发、生产的首选工艺[7]。本研究采用cytodex1微载体，每克表面积为4400 cm2，相当于1个15 L转瓶的表面积，同时这种固体实心的微载体有利于细胞贴壁、伸展和病毒的感染[8]，应用前景广阔。

对于大多数微载体培养来说，一般适宜的细胞接种密度是每个微载体8～12个细胞。本研究中发现ST细胞采用高密度接种时，细胞贴壁后能够很快的伸展，并快速进入到对数生长期；而低密度接种，细胞要经历一个较长的生长期才能达到最高的密度，其细胞的最高密度和生理状态明显要低于高密度接种，这可能与ST细胞的平板效率有关。

对于猪瘟病毒来说，病毒的产量主要取决于培养系统中细胞的密度和细胞状态，而细胞贴壁、细胞接种密度、微载体浓度、营养的供应、搅拌速度等培养参数和培养环境对细胞的生理状态和最终的细胞密度均有直接影响，从而影响病毒的产量。本研究采用3 g/L的微载体浓度，发现DMEM/F12相比DMEM和MEM，能够长时间维持细胞较好的生长状态，至少可以进行病毒的6次收获，说明在生物反应器悬浮培养过程中，选择合适的培养基，为细胞提供充足均衡的营养至关重要。

生物反应器微载体悬浮培养放大是目前公认的技术难点，目前国内大多数企业在培养中采用的种子细胞主要是通过转瓶培养，一次接种需要多个转瓶的细胞，每个转瓶都是一个独立的单元，很容易造成培养的污染，无法满足更大单位体积培养的需要。本研究对微载体的胰酶消化放大培养作了探索，完成了10 L到50 L的放大，并且工艺条件稳定，培养三批，从第二收开始病毒含量均不低于7.0 lgTCID50/mL，同时也进行了部分样品的兔体感染量的测定，不低于400万RID/mL，为工业化大规模培养奠定了基础。