管碟法测定硫酸安普霉素效价的不确定度评定

戴 青，韩宁宁，王 轩，杨秀玉，赵 晖

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

硫酸安普霉素是一种动物专用的氨基糖苷类抗菌药物，《中国兽药典》2015年版一部[1]收载了硫酸安普霉素及其制剂的质量标准，其中含量测定项均采用抗菌药物微生物检定法进行测定。目前，国际上通用的抗菌药物微生物检定法包括管碟法和浊度法，管碟法是各国药典收载的经典抗菌药物微生物检定通用方法。不确定度评定是通过对实验过程各个环节引入的不确定度进行评估，以分析各因素对测定结果的影响[2]。检测结果的可靠性很大程度上取决于测量不确定度大小，测量不确定度越小，说明检测水平越高，检测结果的使用价值越大[3-4]。测量不确定度对于实验室间比对、测量结果临界值的判断、方法的确认及检测工作国际化等方面都具有重要意义[5-6]。本文根据JJF1059-2019《测量不确定度评定与表示》[7]中有关规定，对管碟法测定硫酸安普霉素可溶性粉中硫酸安普霉素含量的不确定度进行了分析与评估，以期为准确认识测量结果与评价检测报告提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 ZY-300IV抗菌药物效价测量仪(北京先驱威锋技术开发公司)；AX-205电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；恒温培养室；安普霉素标准品(中国兽医药品监察所，效价测定用，517单位/mg，批号：K0231610)；硫酸安普霉素可溶性粉供试品(山西新世纪生物制药有限公司，批号：190401，规格：100 g︰10 g(1000万单位))；抗菌药物Ⅰ号培养基(北京中海生物科技有限公司)；枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501(中国兽医药品监察所)；磷酸二氢钾与磷酸氢二钾试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液的制备 精密称取硫酸安普霉素可溶性粉供试品250 mg，置25 mL容量瓶中，加灭菌水溶解并稀释制成每1 mL中约含1000单位的溶液。精密量取该溶液5 mL，置50 mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液(pH 7.8)稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL中约含100单位的溶液。再分别量取100单位/mL的溶液5 mL，分别置50、100 mL量瓶中，用磷酸盐缓冲液(pH 7.8)稀释至刻度，摇匀，得到浓度分别为10单位/mL和5单位/mL的溶液，作为供试品溶液的高、低剂量。

1.2.2 标准品溶液的制备 精密称取安普霉素标准品48 mg，置25 mL容量瓶中，加灭菌水溶解并稀释至刻度，制成每1 mL中约含1000单位的溶液，稀释步骤同供试品溶液。

1.2.3 双碟的制备与培养 取平底双碟约8套(n)，分别加入加热融化的培养基20 mL，放置水平台上使凝固，作为底层。另取加热融化后的培养基适量，放冷至50 ℃，加入枯草芽孢杆菌的菌悬液适量，摇匀，在每一双碟中分别加入5 mL，摊布均匀，作为菌层。冷却后，在每一双碟中以等距离安置不锈钢小管4(k)个，待用。将上述稀释好的标准品溶液与供试品溶液分别滴加于不锈钢小管内，在35～37 ℃恒温培养室中培养16～18 h。

1.2.4 抑菌圈直径的测定与效价计算 取出培养好的双碟，用抑菌圈测量仪测量各个抑菌圈的直径，照《中国兽药典》2015年版一部附录1431生物检定统计法中的2.2法进行可靠性检验与效价计算。当可靠性检验结果为回归非常显著(P<0.01)与偏离平行不显著(P>0.05)时，实验结果才成立。

2 结果与分析

抑菌圈直径测定时，对供试品溶液进行扫描测定，测定结果见表1。

2.2 不确定度来源分析 对抗菌药物微生物检定法的二剂量管碟法测量不确定度来源进行分析，可将影响硫酸安普霉素效价测定的不确定度因素归为：抑菌圈直径重复测量的不确定度，抑菌圈测量仪的不确定度，配制溶液(包括称量、稀释、定容等操作)的不确定度以及重复性试验引入的不确定度。

表1 抑菌圈直径测量结果

2.3 各分量的不确定度

2.3.1 抑菌圈直径重复测量的不确定度分量 对抑菌圈直径的数据进行统计分析，根据上述公式计算效价(y)为102.95单位/mg，同时统计分析得自由度f=(k-1)(n-1)=21，其合并样本标准差即标准不确定度为：

相对标准不确定度为：u(x1)rel=u(x1)/y=0.080/102.95=0.00078。

u(x2)rel=u(x2)/x=0.012/19=0.00063。

2.3.3 配制溶液的不确定度分量 分为标准品溶液的配制与供试品溶液的配制。

2.3.3.1 标准品溶液的不确定度 标准品与供试品溶液稀释过程中主要使用的是A级玻璃量器，由单个玻璃量器体积引入的合成不确定度为

A级100、50、25 mL单标线容量瓶的允许误差分别为：±0.10、±0.05、±0.03 mL，以B类不确定度计算，按三角分布估计，则标准不确定度分别为：

uv1=0.10/6=0.04 mL，uv2=0.05/6=0.02 mL，uv3=0.03/6=0.01 mL。

相对标准不确定度分别为：

uv1rel=0.04/100=0.0004，uv2rel=0.02/50=0.0004，uv3rel=0.01/25=0.0004。

配制溶液时，实验室温度接近21 ℃，容量器皿校准温度为23.8 ℃，近似于矩形分布。

使用100 mL容量瓶、50 mL容量瓶、25 mL容量瓶，因此，定容体积的合成标准不确定度为：

= 0.0009

2.3.3.2 供试品溶液的不确定度 定容体积的标准不确定度同标准品溶液定容体积的标准不确定度，移取溶液的不确定度分量同标准品溶液移取溶液的不确定度，供试品质量的标准不确定度同标准品质量的不确定度，供试品质量的相对标准不确定度为：0.017/250.50=0.00007。

2.3.3.3 配制溶液的不确定度

2.3.4 重复性试验引入的不确定度 结果如表2所示。重复性试验取供试品两份，同时操作，用极差评定相对不确定度：

表2 硫酸安普霉素效价重复性试验测定结果

=0.0085。

2.4 总合成标准不确定度

0.0088。

2.5 扩展不确定度Uu(x)/x=0.0088，x=103.65单位/mg，u(x)=0.0088×103.65 =0.91单位/mg。本试验采用置信概率为95%的包含因子，根据t分布表，取k=2，则扩展不确定度为U=2u(x)=2×0.91=1.8单位/mg。硫酸安普霉素效价测定的结果可表示为：(103.6±1.8)单位/mg(k=2)。

3 讨论与结论

参照《中国药品检验标准操作规范》[8]，二剂量管碟法加样顺序为：高浓度标准品溶液→高浓度供试品溶液→低浓度标准品溶液→低浓度供试品溶液，每次滴加的溶液应为同一浓度。由加样时间引入的不确定度对测定结果的影响为系统误差，在试验中，应尽量减少加样时间，以将该因素的影响控制在最小，在不确定度评定中做零项处理[9-10]。

综上，各因素对测定结果的影响依次为：重复性试验>溶液稀释>抑菌圈直径重复测量>抑菌圈测量仪>样品称量。由此可见，本试验标准品与供试品称量引入的不确定度最小，仪器引入的不确定度次之，而测量不确定度的主要来源为重复性试验，其次为溶液的稀释过程，提示试验人员应注意效价测定过程中稀释定容的操作过程，并注意保持重复性试验条件的一致性，可采用四分法取样以保证试验样品的均匀性。通过对硫酸安普霉素效价的不确定度评定，有助于准确衡量检测结果，为提高抗生素效价测定结果的准确度提供了参考依据。