NHE1在神经系统疾病中的研究进展

吴旭玲，冯占辉，叶兰

钠氢交换体(Na+/H+exchangers，NHE)在哺乳动物中广泛存在，其功能是介导细胞内的H+和细胞内外的Na+进行等比例交换从而调节细胞内的pH、维持细胞容积，参与细胞生长、增殖、迁移及细胞凋亡的调控过程。NHE包括10个亚型 ，NHE1在细胞中普遍表达，NHE2-4主要表达于上皮细胞和周围组织中，NHE5在脑组织中有表达，NHE10则特异表达于破骨细胞中，调控破骨细胞的分化[1]。根据各亚型在细胞内的分布不同可分为细胞质膜簇和胞内细胞器簇，NHE1-5、NHE10表达于细胞膜上，属于质膜簇蛋白，NHE6-9则表达于线粒体、高尔基体等细胞器膜上[1-2]。目前关于NHE各亚型的研究中，和神经系统疾病相关联的有NHE1、NHE6和NHE9三种亚型，NHE1与癫痫关系较为紧密，而NHE6和NHE9主要与智能障碍相关[3-4]。NHE1是NHE家族中分布最广的亚型，且在神经组织中有广泛的表达。NHE1主要表达于脑和周围神经系统[5]，在脑内海马和皮层组织中表达丰富。NHE1是一种细胞膜蛋白，位于细胞质膜上，在胞内细胞器膜上没有NHE1的表达[2]。NHE1氮端跨膜区域由500个氨基酸组成了12个α螺旋跨膜片段，称作离子通道结构域，胞内结构域由315个氨基酸组成，其中包含有9个磷酸化位点，可以调节细胞内的信号转导。NHE1主要发挥细胞管家的作用，防止细胞内过度酸化，维持细胞内酸碱平衡。NHE1活化通过胞内碱化机制实现，排出胞内H+摄入Na+，同时还藕联摄入1个Cl-和1个水分子，可以使失水的细胞维持原有的细胞容积[2]。

近年来，NHE1对pH的调节作用是心脏疾病和肿瘤性疾病中的研究热点，心肌缺血导致心肌细胞内pH降低，激活NHE1引起胞内Na+和Ca2+浓度变化，继发参与心肌缺血再灌注损伤、心肌肥厚、心力衰竭等病理过程[6-7]。肿瘤细胞微环境中的酸碱平衡与肿瘤的表现特性紧密相关，NHE1可以通过调节细胞微环境中的pH变化，参与调节肿瘤的增殖、分化和侵袭等病理过程[8]。

在神经系统中，NHE1同样扮演着非常重要的角色。NHE1是中枢神经系统主要的pH调节因子，通过对细胞内pH的调节，引起细胞内离子浓度改变诱发一系列的级联反应参与不同的病理生理过程。在调节离子稳态、细胞生长、凋亡和血脑屏障完整性[9]等方面都有重要作用。最近的研究发现，轴突导向因子netrin-1诱导神经突生长过程依赖Rho GTP酶家族的激活，使用NHE1抑制剂卡泊来德可以阻断对神经突的促生长过程，且在抑制NHE1的表达后，神经元Rac1、Cdc42 和RhoA的活性降低，表明NHE1是Rho GTP酶家族的上游分子，能促进神经突的生长[10]。NHE1参与了神经系统中的多种病理生理过程，与多种神经系统疾病相关。

1 NHE1与癫痫

NHE1与癫痫发病关系密切。Cox等[11]在基因敲除小鼠模型中观察到小鼠表现共济失调，并出现失神发作和强直阵挛发作两种特征性的痫性发作形式，推测其机制可能是由于在NHE1缺乏的情况下，神经元无法调节pH值的瞬时变化，导致同步痫样放电的启动或传播阈值的降低而出现癫痫发作。随后，Gu等[12]建立NHE1基因无义突变小鼠模型，发现突变小鼠海马神经元细胞兴奋性显著高于野生型小鼠，同时NHE1突变鼠电压门控Na+通道表达增多，Na+通道电流也显著增多，推测NHE1是通过对Na+通道的表达和调控来改变神经元兴奋性从而参与癫痫疾病过程。Xia等[13]的研究也与前者研究结果相一致，在NHE1功能缺失小鼠脑内CA1区和皮层神经元的Na+通道表达增多、Na+电流增强、神经元细胞膜兴奋性也增高。此外，有学者在实验小鼠中分别特异性敲除谷氨酸能兴奋性神经元和GABA抑制性中间神经元的NHE1基因，结果显示抑制性神经元中敲除NHE1后，小鼠表现出癫痫样活动，而兴奋性神经元中敲除NHE1则没有影响，证明了NHE1是通过抑制性中间神经元调节神经网络兴奋性而参与癫痫的发生发展[14]。上述结果都表明NHE1缺失在癫痫疾病中有重要作用，与此相反，另外有一些研究在不同的癫痫动物模型中发现存在NHE1的激活。Kang等[15]发现在沙鼠痫性发作后30 min到3 h期间NHE1的表达增高，在戊四氮癫痫模型中，NHE1抑制剂阿米洛利能发挥较好的抗惊厥效应，癫痫点燃潜伏期延长、发病率降低、严重程度减轻，且阿米洛利的抗惊厥作用呈剂量依赖性[16]。我们在匹罗卡品癫痫大鼠的海马组织以及癫痫患者脑组织中都检测到NHE1表达的升高[17-18]。研究显示阿米洛利的抗惊厥效应主要通过间接抑制谷氨酸能系统、细胞内酸化减少Ca2+超载来实现，因此，NHE1在细胞酸化时排出胞内H+，会导致细胞兴奋性增高诱发痫样放电。

由此可见，NHE1异常表达可通过不同的分子通路参与癫痫的发生，一方面，在NHE1突变小鼠中，NHE1表达缺失后神经元生理稳态发生改变会导致继发性的离子通道改变，Na+通道及Na+电流增多使神经元兴奋性增高，这与癫痫发病密切相关。另一方面，在细胞酸化条件下，NHE1激活将细胞内H+排出直接导致神经元兴奋性增高，同时，H+与Na+交换，胞内Na+浓度增高，可激活其他Na+转运蛋白[2]：胞内高钠激活Na+-K+-ATP酶，Na+-K+-ATP酶在每消耗1个ATP的情况下可以将3个Na+排出细胞并摄入2个K+；细胞内高钠还会激活钠钙交换体(Na+/Ca2+exchange,NCX)的逆向转运功能，导致神经元胞内Ca2+超载、促进兴奋性谷氨酸的释放，神经元内过度Ca2+超载也会活化钙激活中性蛋白酶calpain通过caspase3途径促进继发性的神经元凋亡参与到癫痫的病理过程[19]。因此，NHE1的激活与失活在癫痫发病中的作用仍存在较大争议，有待更深入的研究来阐明其在癫痫发病中的详细机制。

2 NHE1与缺血性脑损伤

缺血性脑损伤主要包括脑梗死和围产期缺血缺氧性脑损伤。许多研究都表明，NHE1激活在缺血再灌注损伤中发挥重要作用，在抑制NHE1后能发挥神经保护作用[20]。Luo等在脑缺血细胞模型中，糖氧剥夺3 h后复氧21 h，观察到神经元死亡率高达70%，但添加了NHE1特异性抑制剂HOE642的神经元经过同样的缺氧复氧过程，最后观察到神经元的死亡率显著降低，NHE1基因敲除神经元细胞缺氧复氧后的死亡率也显著降低，同时，作者还观察到缺氧会导致细胞内Na+和Ca2+浓度增加，抑制NHE1的功能能够阻断这种变化[21]。同样的，在小鼠载体模型中也观察到抑制NHE1后在缺血缺氧性脑损伤中有神经保护作用，在应用NHE1抑制剂阿米洛利后可以通过氧化应激途径减少小鼠全脑缺血模型中海马神经元的死亡[20]。此外，也有学者发现在大鼠大脑中动脉闭塞1 h后静脉注射NHE1选择性抑制剂SM-20220，可以显著减少发生脑水肿的范围和梗死体积[22]，在乳猪的围产期窒息模型中使用NHE1抑制剂后也可以有效减少大脑皮质和皮质下白质的细胞死亡[23]。Matsumoto等[24]的研究显示，在体外培养大鼠神经元中，NHE 抑制剂和 N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体拮抗剂都能减少谷氨酸诱导的神经元死亡，这进一步说明NHE活化的毒性效应是间接通过谷氨酸的释放来介导的，谷氨酸的释放会导致细胞内Ca2+超载、线粒体功能障碍和ATP合成障碍，进而导致NHE的进一步激活。

除了调控神经元细胞的pH，NHE1在胶质细胞的pH调控中也起到重要的作用。体外培养的星形胶质细胞在缺氧后胞内pH降低，复氧后仍有大约40%的细胞死亡，给予NHE1抑制剂处理后星形胶质细胞的死亡数量也显著减少[25]。在大鼠脑缺血模型中发现NHE1在缺血区域的表达显著增高[26]，成年沙鼠在全脑短暂性缺血后CA1区星形胶质细胞中NHE1的表达也增高，这些都说明星形胶质细胞通过上调NHE1对缺氧引起的细胞内酸化进行应答。选择性敲除胶质细胞中NHE1基因的小鼠与野生型小鼠相比，在缺血性卒中后胶质细胞死亡数量减少、新生的血管增加、脑血流灌注更丰富、血脑屏障功能也更完整[27-28]。此外，还有研究显示星形胶质细胞中的NHE1与脑缺血后白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、金属蛋白酶9(matrix metallopeptidase，MMP-9)等促炎症因子的释放有关[29]。体外培养的小胶质细胞糖氧剥夺后激活NHE1也会导致胞内pH升高、Na+和Ca2+浓度升高等有害的细胞事件，应用卡泊来德(HOE642)可以有效减轻这种损害[30]。Shi等[31]在在体动物模型中验证了大脑局部缺血后，梗死区域周围活化的小胶质细胞中NHE1表达升高，使用NHE1抑制剂HOE642或者对小鼠进行NHE1基因敲除后，活化的小胶质细胞数量减少，促炎症因子表达也显著降低。缺血缺氧时星形胶质细胞和神经元NHE的激活都会引起谷氨酸的释放和Ca2+超载，而卡泊来德可以减少谷氨酸诱导的神经元凋亡坏死，同时减少细胞内Ca2+超载和活性氧的产生[32]。

3 NHE1与神经病理性疼痛

神经病理性疼痛的病因多种多样，包括离子通道病变、神经压迫、自身免疫性疾病和外伤等[33]，NHE1的功能变化也会改变神经细胞内离子的稳态而引起神经病理性疼痛。有研究发现在福尔马林诱导的大鼠疼痛模型中，双侧的背根神经节和脊髓后角NHE1的表达均减低，表明不管在周围神经还是脊髓，NHE1都参与了疼痛的信号转导通路[34]，在炎症中，抑制NHE1后细胞内Ca2+浓度增加，可以激活瞬时受体电位锚蛋白1 (TRPA1)，从而易化疼痛的产生[35]。与此相反，另外有研究显示，腹腔注射阿米洛利可以减轻长春新碱诱发的神经病理性疼痛，应用NHE1抑制剂唑泊来德后可使后跟神经的复合动作电位波幅降低，其主要机制与NHE1抑制剂能迅速使快钠通道失活、周围神经的兴奋性降低有关[36]。此外，还有研究显示在大鼠和狗身上持续静脉使用唑泊来德1个月后又会出现脊髓后索、后跟以及后跟神经节的损害[37]。到底NHE1在神经病理性疼痛中扮演怎样的角色，还有待进一步的探究。

4 NHE1与其他神经系统疾病

亨廷顿病是由于体内异常的亨廷顿蛋白聚集所导致的神经退行性疾病，正常的亨廷顿蛋白在调节Ca2+稳态中发挥重要作用，在亨廷顿基因(HTT)突变的细菌模型中，由cAMP梯度诱导的K+和Ca2+的趋化作用消失，不能介导细胞的形态发生，这与NHE1基因突变表现出的表型相一致，在htt-和nhe1-细胞中，肌动蛋白的定位存在异常，nhe1基因正常的情况下，htt-也会导致NHE1蛋白定位的异常，由此推断Htt直接或间接作用于NHE1发挥作用[38]。在对神经胶质瘤的研究中，NHE1介导胶质瘤相关小胶质细胞的葡萄糖代谢失调，发挥免疫抑制作用，认为NHE1可以成为胶质瘤免疫治疗的新靶点。阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种神经系统的退行性疾病，AD患者脑内存在异常的淋巴增殖，同时伴随细胞内的碱化，应用NHE抑制剂可以阻止淋巴细胞的增殖，推测NHE激活在AD淋巴细胞增殖病理中起重要作用[39]，在动物实验中应用NHE1抑制剂阿米洛利可以改善癫痫小鼠的记忆障碍，还能提高缺血缺氧性新生小鼠的空间学习能力，这些表明NHE1与认知障碍性疾病可能也存在关联性。除此之外，应用NHE1抑制剂还会影响缺血所致神经功能的恢复：在低温缺氧乳猪模型中观察到使用了HOE642的个体可以快速恢复其神经功能，NHE1抑制剂在保护海马神经元免受缺血性损害的同时，也能改善缺血再灌注后导致的肢体自发性运动，还有学者观察到应用NHE1抑制剂可以缩短沙鼠脑缺血后所致意识障碍的时间。因此，NHE1可能在多种神经系统疾病中发挥作用。

综上所述，NHE1是一个离子转运蛋白，基本功能是调节细胞内pH变化来维持细胞酸碱平衡，其次，NHE1可通过改变胞内其它离子浓度的变化，促进谷氨酸释放，改变细胞兴奋性，参与细胞凋亡、骨架重组以及炎症等病理过程，虽然在多种神经系统疾病中都观察到有NHE1表达的异常，但是NHE1 在疾病中发挥的真正作用以及其参与疾病的具体分子转导机制还有待进一步探索。