金黄色葡萄球菌生物膜形成及调控机制研究进展

李新圃，罗金印，武小虎，李宏胜，丁学智 (中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所 农业农村部兽用药物创制重点实验室/甘肃省中兽药工程技术研究中心，甘肃 兰州 730050)

金黄色葡菌球菌(金葡菌)是一种生存能力极强且分布十分广泛的条件性致病菌，既可作为一种无害的共生物存在于环境中以及人和动物的皮肤黏膜表面，又可引起许多感染性疾病，小到轻度浅表感染大到严重危害生命的重症感染。在病理条件下，金葡菌能够释放多种致病性毒素，例如肠毒素A、α-溶血素、凝集因子A、纤维蛋白结合蛋白A、杀白细胞素、中毒休克毒素、血浆凝固酶、剥脱毒素A和耐热核酸酶等，并且能够针对治疗的抗生素启动相应的耐药机制，归纳起来主要包括[1]：①促进药物外排；②使酶制剂改性和失活；③药物的结合位点被酶修饰；④产生干扰物质与药物争夺结合位点；⑤通过一些旁路机制获得耐药性；⑥通过基因突变改变药物作用位点和细胞壁/膜的药物渗透性等。

能够促使金葡菌释放毒素并启动耐药机制的病理条件，除了宿主本身免疫力下降和组织器官受损外，一个十分重要的因素就是金葡菌极易形成生物膜。生物膜是细菌通过自身分泌的胞外基质(ECM)相互黏连形成膜状细菌群体，具有极强的黏附性、环境适应能力和自身保护作用[2]。自然环境中大多数细菌都能以生物膜的形式存在，生物膜能够黏附在宿主的组织表面，一旦组织细胞受损，致病菌能够不断释放毒素引发感染，并且可能进入机体内随血液流动播散，导致全身性感染。在所有微生物和慢性感染中，分别有65%和80%与生物膜形成有关[3]。金葡菌生物膜还能够抵御宿主免疫系统，更容易产生耐药菌株，甚至多重耐药菌株，这些耐药菌株是导致慢性感染的主要病原，给人类和家畜的健康及生命造成极大的危害[4]。

1 金葡菌生物膜的形成机制

1.1 金葡菌生物膜细菌可以通过最初的黏附聚集，最终形成具有一定功能和结构的成熟生物膜，其功能结构十分复杂。研究发现，细菌生物膜是被自身产生的ECM包裹的细菌多细胞团体[2]。细菌可通过ECM自我屏蔽保护，免受逆境压力。一些不利条件，例如营养限制或饥饿、化学物质和物理作用的攻击等，均可触发生物膜的形成。金葡菌ECM的主要成分是胞外多糖、蛋白质、磷壁酸和胞外DNA(eDNA)，并且每种成分的组成和比例都会因菌株不同而存在差异[5]。目前金葡菌生物膜的研究仍以体外模型为主，其形成机制主要存在两种理论：一是基于最初的研究，认为金葡菌生物膜的形成与多糖胞间黏附素(PIA)有直接的关系，但进一步的研究发现，没有PIA的金葡菌也能形成生物膜，因此根据生物膜初始黏附阶段是否存在PIA，将生物膜形成分为PIA依赖和PIA非依赖途径，即ica依赖和ica非依赖途径[6]。二是随着研究的深入，发现生物膜的形成过程可以分为4个阶段，即初始附着、细胞聚集形成多细胞层、生物膜成熟并分离出单个浮游菌、膜表面的浮游菌分散并开启新的生物膜周期[7]。这两种理论相辅相成，从不同的侧重点研究和阐明金葡菌生物膜的形成机制。

1.2 基于PIA的生物膜形成机制

1.2.1PIA依赖途径 金葡菌生物膜形成过程的附着积累阶段主要依赖于PIA，其合成主要受基因ica调控[8]。ica包括4个功能基因icaA、icaD、icaB和icaC和一个调节基因icaR。icaADBC编码的葡糖胺转移酶诱导产生胞外多糖，主要成份是PIA，它是β-(1，6)-N-乙酰葡糖胺多聚体(PNAG)，所以也被称为PNAG，是生物膜基质中的主要多糖组分，是细胞成簇的主要功能性物质，能够促进细菌之间的黏附聚集和细菌黏附到生物材料表面[9]。icaR是一个阻遏基因，敲除icaR或抑制icaR转录，icaABCD表达上调，PIA合成量增加，生物膜形成能力增强。PIA作为ECM的多糖成分在早期金葡菌生物膜形成过程中发挥重要作用，然而金葡菌icaA突变体缺乏PIA也能表现出正常的细胞积累作用，并且一些具有ica基因和PIA的菌株反而不能形成生物膜，说明金葡菌生物膜的形成并不完全依赖于PIA，还存在PIA非依赖形成途径。

1.2.2PIA非依赖途径 有些金葡菌菌株以不依赖PIA的方式黏附积累，如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)主要通过蛋白质而不是多糖形成生物膜[10]。金葡菌表面肽聚糖上共价锚定着一组以N端含有信号肽序列、C端含有“LPXTG”模体为特征的表面蛋白即细胞壁锚定(CWA)蛋白[11]，其中有一类能和ECM成分结合的蛋白分子，被称为识别黏附基质分子的微生物表面成分(MSCRAMM)，它们被认为可以促使金葡菌牢固定植到特定的组织细胞表面以及附着在有血浆蛋白和胞外基质蛋白的非生物材料表面，参与细菌黏附聚集形成生物膜[12]。MSCRAMM家族主要包括凝集因子A(ClfA)和B(ClfB)，它们是介导金葡菌黏附到纤维蛋白原的表面黏附素[13]；纤维蛋白结合蛋白(FnBPs)是一类可以促进金葡菌与纤维蛋白原、弹性蛋白和纤连蛋白结合的多功能蛋白，其中的FnBPA和FnBPB主要参与菌体与生物表面的初始附着以及相邻细胞间的黏附，介导生物膜的形成[14]；丝氨酸-天冬氨酸重复序列蛋白(Sdr)，其中的SdrC、SdrD和SdrG可以促进与纯化的鳞状细胞黏附[15]；骨唾液酸结合蛋白(Bbp)，能够与纤维蛋白原结合，促进与胞外基质的黏附[9]；胶原黏附素(Can)，具有识别胶原蛋白三螺旋结构的作用，可以黏附到富含胶原蛋白的组织细胞上[16]。

最初使用MSCRAMM术语是认为金葡菌主要附着在细胞表面的糖结合物上[17]，但进一步的研究发现，一些能够促使金葡菌定植黏附的CWA蛋白并不都是MSCRAMM家族成员，并且有些MSCRAMM蛋白除了能够促进细胞间黏附外还有其他功能。因此，有人根据结构和功能将CWA蛋白分为4大类[15]，最大一类是MSCRAMMs蛋白，其特征具有DLL(dock， lock and latch)配体结合机制[18]，主要功能是参与细菌黏附和聚集，促进生物膜形成。其他介导生物膜形成的CWA蛋白还有铁离子调控表面蛋白(Isd)、蛋白A和金葡菌表面蛋白G(SasG)。Isd包括IsdA、IsdB和IsdH，它们的配体结合机制均与NEAT(near iron transporter)基序有关[19]，能够选择性识别血红素、纤维蛋白原、纤连蛋白、K10、叶黄素和β3整合素，促进细菌与生物细胞及其胞外基质的黏附；蛋白A在金葡菌中普遍存在，是一种多功能蛋白，具有重复三螺旋束结构，可以结合多个不同的配体，在生物膜形成过程发挥作用[20]；SasG与积累相关蛋白(Aap)密切相关，Aap是表皮葡萄球菌生物膜形成所必需的蛋白，它们均有G5-E结构(G5结构域被E区的50残基序列隔开)[21]。另外，在MRSA中发现的纤溶酶敏感表面蛋白(Pls)是SasG同源物，可能与SasG有相似的功能机制，可黏附上皮细胞促进生物膜形成[22]。还有一类CWA蛋白在生物膜形成过程发挥重要作用，但它们的作用机制不是很清楚，例如生物膜相关蛋白(Bap)，能够增进金葡萄在上皮细胞表面聚集促进生物膜形成，还有金葡菌表面蛋白X(SasX)和C(SasC)，在生物膜形成过程中促进金葡萄黏附和聚集[23]。

1.3 基于阶段性发展的形成机制

1.3.1初始附着 金葡菌与非生物表面之间存在非特异性附着[24]。金葡菌可通过静电和疏水作用附着在非生物表面上，ECM的成分磷壁酸带有负电荷，能够附着在聚苯乙烯和玻璃表面。自溶素(AtlA)有助于细胞在聚苯乙烯表面附着，atlA基因突变体在非生物表面形成生物膜的能力降低。金葡菌与生物表面之间还存在特异性附着。为了在生物体表面形成生物膜，浮游菌首先利用各种针对不同基质底物的CWA蛋白附着在生物体表面，这些CWA蛋白对宿主基质成分如纤维蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白、细胞角蛋白等具有不同的结合特异性，前面已进行了简要介绍(详见1.2.2)，这里不再累述。

1.3.2细胞聚集 初始附着后，为了维持尚未成熟的生物膜稳定，金葡菌会产生有助于稳定细胞间聚集的多种因子。研究显示，细胞质蛋白烯醇酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)能够响应生物膜环境的pH值降低，与eDNA结合附着在细胞表面，成为金葡菌生物膜的基质成分[25]。尽管尚不清楚这两个缺乏信号肽的细胞质蛋白到达细胞外环境的转运机制，但有人分析认为，随着生物膜发育进入增殖阶段，一些死亡细胞裂解并释放DNA、细胞质蛋白烯醇酶和GAPDH等到细胞外环境成为ECM成分，并且相互作用促进细胞聚集，为生物膜的成熟奠定基础[12]。此外，通常作用于染色体构造的胞质核苷关联蛋白(NAPs)也可通过结合eDNA充当ECM组分蛋白，促进生物膜形成[26]。eDNA是一种潜在的静电聚合物，可以促进细菌之间相互黏附和附着在生物体上，甚至黏附到非生物体上[27]。

1.3.3生物膜成熟 DNA和蛋白质在生物膜成熟过程中发挥重要的作用。eDNA是重要的生物膜基质成分，大多来自菌体自溶释放的DNA，其过程受细胞壁水解酶介导和操纵子(cidABC/lrgAB)调控。cidABC/lrgAB具有类似穿孔素/抗穿孔素(holin/antiholin)的作用，cidA发挥holin的功能，可以在细胞膜形成孔道转运细胞壁水解酶，而lrgA发挥antiholin的作用，抑制cidA作用调控eDNA产生[28]。同时eDNA被自身分泌的核酸酶(Nuc)降解使生物膜的总生物量减少[29]。eDNA起源于细胞裂解，并通过质粒插入其他菌的转座子或致病岛，有助于交换遗传物质，使毒力因子和抗生素耐药因子基因被交流[1]。使用Nuc降解eDNA，生物膜总量明显减少，细菌对杀菌物质的敏感性显著增加[28]。Nuc介导eDNA降解促进生物膜解离，可能是生物膜发育过程一个重要的调控阶段，以便结构重建，形成更有利于生物膜发展的结构形态。

研究显示，金葡菌生物膜在成熟过程中，不断有细菌挣脱黏附，并残留在基底层的细胞上形成微菌落结构，这一过程受操纵子cidABC和lrgAB的调控，这些微菌落的生长和分散速率均不完全相同[30]。由于微菌落的不断解离和形成，生物膜结构不断得到修饰和重塑，其中酚溶性调控蛋白(PSMs)发挥重要的介导作用。PSMs是一类具有α-螺旋结构的多肽两性分子，具有表面活性剂的特点，可以破坏生物膜基质中大分子间的静电和疏水作用，介导生物膜的分散[31]。PSMs主要在生物膜形成过程产生解离作用，若将PSMs加入到成熟的生物膜中，不能破坏成熟生物膜基质中多糖等大分子间的共价键[32]。当psm基因突变不能正常表达时，金葡菌生物膜内部微孔道减少、结构变厚，表面变得光滑[33]。

1.3.4生物膜的分散 成熟的生物膜外观呈现蘑菇状，内部的细菌不断被解离和重新聚集，结构不断修饰完善，当细菌密度达到一定的功能阈值时，就会触发信号传导系统，使生物膜进入分散阶段，生物膜外表面的细菌脱离生物膜成为浮游菌，四处散播、附着，开启新的生物膜周期，周而复始，造成病原菌不断传播，感染反复发作难以治愈[7]。金葡菌生物膜的分散在很大程度上受附属基因调节子(Agr)调控[33]。Agr系统可调控相关细胞外蛋白酶的分泌，这些蛋白酶包括金属蛋白酶(Aur)、半胱氨酸蛋白酶(ScpA、SspB)、丝氨酸蛋白酶(SspA或V8)和丝氨酸类蛋白酶(SplA、SplB、SplC、SplD、SplE、SplF)，它们与生物膜的解离密切相关，敲除这些蛋白酶基因或加入蛋白酶抑制剂能够明显抑制生物膜的解离[34]。当Agr低表达时，菌体表面的黏附因子不能被有效抑制，金葡菌生物膜形成能力增强，而当Agr高表达时，金葡菌生物膜形成能力降低，同时细胞外毒素分泌增多[35]。

Agr调控的生物膜分散机制涉及到PSMs的产生和作用。AgrA可以结合到细菌DNA的相应位点，降低表面蛋白的基因表达水平，促进psmα和psmβ转录，有助于生物膜分散[36]。而且PSMs只能在生物膜形成过程产生解离作用起到重塑结构的作用，不能破坏已成熟生物膜基质中的多糖等大分子间的共价键分散生物膜[32]，可能PSMs的作用主要是“形成状态”影响了生物膜的完整性。虽然大多数研究显示PSMs的类表面活性剂作用促进了生物膜的分散，但也有相反的研究结果，PSMs能够聚集成不溶性淀粉样纤维有助于维持生物膜结构，阻止生物膜扩散[37]，并且eDNA的存在促进了这些淀粉样结构的形成[5]。这些看似矛盾的研究结果恰好说明生物膜不仅具有复杂的组成结构，而且存在复杂的调控系统，ECM成分之间通过相互协同和制约不断促进生物膜的发展。分散是生物膜发展过程必不可少的作用模式，一方面有利于生物膜内的部微菌落重建，在基因表达、ECM组成和代谢水平上多样化发展，能够更好地抵御环境中的抗菌因子。另一方面有助于生物膜外部细菌脱离生物膜成为浮游状态，恢复对抗菌药物的敏感性，同时重新感染宿主、传播病原和释放毒素。

2 金葡菌生物膜的调控系统

2.1 QS系统细菌生物膜的形成有复杂的网络调控系统调控，目前研究较多的主要是QS系统。QS是监测菌群数量和密度并感应周围环境的重要机制，当信号分子浓度达到阈值，细菌可通过改变相关基因的表达，调控自身行为适应环境变化[36]。在QS调控下，细菌能够分泌特定的信号分子并感应它的浓度变化，调控一些生物学功能，例如生物膜的形成和毒力因子的分泌等[38]。QS系统由一系列调控因子组成，葡萄球菌主要涉及到的调控因子有Agr、BigB、SarA、LuxS/AI-2蛋白和基因。

2.2 AgrAgr是金葡菌QS系统中最有代表性的调控因子，主要调控生物膜的解离和分散。Agr系统由AgrA、AgrB、AgrC和AgrD蛋白组成，由启动子P2和P3启动转录[39]。AgrD编码自诱导肽(AIP)，AgrB有助于AIP的成熟和输出，当细胞外AIP浓度达到阈值时，AgrC结合AIP使AgrA磷酸化，激活P2和P3。P2启动RNAⅡ转录，编码AgrA、AgrB、AgrC和AgrD。P3启动转录效应分子RNAⅢ转录，通过不同途径调控生物膜相关基因和一些毒力因子的表达。AgrA能够增强PSM表达，促进生物膜分散[36]。Agr还能够调控蛋白酶表达，降低金葡菌对细胞表面的黏附能力，促进生物膜的解离和分散[34]。当agr基因缺失时，金葡菌生物膜变厚、微孔道减少、表面更为光滑、失去解离播散能力，形成广泛而密实的生物膜，更倾向于形成局部慢性感染[40]。

2.3 SarSarA蛋白与金葡菌生物膜的形成密切相关，在一定条件下促进Agr和RNAⅢ的表达，调节一些毒力基因的表达，对生物膜的形成和毒素的产生有重要的调节作用[41]。研究显示，SarA可以特异性结合bap基因，启动其表达，活化Bap蛋白，促进生物膜的形成；抑制核酸酶和蛋白酶的活性，减少eDNA及蛋白质的降解，有利于细菌黏附和聚集；促进ica转录参与金葡菌PIA的合成与调节，有助于PIA依赖生物膜的形成[42]。也有研究发现，SarA在金葡菌对数生长期上调CWA表达，抑制胞外蛋白酶的产生，促进细菌黏附和早期生物膜形成，而在对数生长后期结合到自身启动子，促进生物膜的解离和播散，说明在金葡菌生物膜发展的不同阶段，SarA通过发挥不同的作用，正向调控生物膜的形成[43]。因此，下调和敲除sarA均能降低金葡菌生物膜的形成能力[44]，同时提高对抗生素的敏感性。

2.4 转录因子SigBSigB(Sigma B)也被称为σB，是调控金葡菌生物膜形成及毒素因子表达的重要因素，其功能比较复杂。研究发现，SigB可以通过调控agr和sar基因影响金葡菌生物膜的形成[45]；能够降低核酸酶和蛋白酶的活性，促进eDNA释放，增强生物膜的形成能力[46]；还能够促进icaADBC转录水平增强，有助于PIA依赖金葡菌生物膜的发育，其突变株由于缺失sigB基因限制了生物膜的形成[42]。但也有不同的研究结果，在SigB存在下，Ica蛋白的转换加速，PIA的合成减少，生物膜形成能力降低，而SigB突变体能够积累更高水平的IcaC蛋白，比野生菌株产生更高水平的PIA，使生物膜形成能力增强[47]。这些看似矛盾的研究结果可能与金葡菌生物膜基质的差异性和多变性有关[5]，同时也反映了SigB在金葡菌生物膜形成过程具有多重作用和功能。

2.5 信号传导系统(LuxS/AI-2)该系统是革兰阳性和阴性细菌可共享的一个QS系统，可以介导非同种细菌之间的信号传导[48]。在大多数革兰阳性和阴性菌中都发现了自诱导物(AI-2)，其介导细菌间的信号交流，在细菌生物膜协同生长中起关键性作用[49]。AI-2衍生自4，5-二羟基-2，3-戊二酮(DPD)，DPD由酶(LuxS)活化甲基环而合成。AI-2是能够相互转化的化学构体结构，而不是单一的化合物。LuxS/AI-2系统通过上调IcaR，抑制icaA的转录，降低PIA依赖性生物膜的形成能力。敲除luxS基因可使IcaR下调，添加外源性AI-2可恢复其表达。因此，LuxS/AI-2可能对PIA依赖性生物膜的形成起负调控作用。

3 小结与展望

对生物膜组成结构的研究发现，由于金葡菌生物膜形成大量的ECM，能够产生物理屏障，影响抗生素的扩散和分布，降低其杀菌作用，同时生物膜内部的细菌处于休眠状态，生长代谢缓慢，影响各类抗生素在细菌不同生长阶段发挥作用。生物膜形成机制相关研究发现，金葡菌生物膜不仅是细菌与ECM之间的黏附和堆砌，而且具有一定的功能性、结构性和调控性，能够有序完成生物膜的黏附、聚集、成熟和播散，周而复始，导致菌体在感染部位难以被彻底清除，从而造成感染难以治愈，病原不断扩散。对生物膜调控系统的研究发现，金葡菌生物膜涉及的调控因子，不仅参与生物膜的形成和调控，而且还参与其他毒素的释放和调控，与金葡菌强大的耐药性和致病性密切相关。相比浮游状态，生物膜中的金葡菌对大多数抗菌素的敏感性降低，而耐药性可提高10～1 000倍[50]。

金葡菌的耐药问题不仅表现在临床治疗中，并且对新药的开发研究也造成极大的影响。尽管目前抗菌药物的研发已经取得很大的成效，但研发一个新药仍需花费巨大的人力、物力、财力和时间。大多数抗生素只要应用到临床上，就会产生耐药菌株，尤其是金葡菌，很容易产生耐药菌株，甚至多重耐药菌株，不仅增加了新药研发的成本，而且增大了研发的难度。因此，想要有效对抗金葡菌等引发的各种感染，就必须通过多种途径，降低病原菌的耐药性，充分发挥抗菌药物的抗菌疗效，例如群体感应抑制剂(QSI)的研究就是目前倍受关注的研发热点。QSI是指对QS系统及其调控因子具有靶向干预作用的化合物，具有不易产生耐药菌株的治疗优势。因此，有必要及时了解金葡菌生物膜形成机制方面的研究进展，更好地确立研究的目标和方向。