miRNA-370及其靶基因Wnt3a和KITLG在白色和棕色绒山羊皮肤中的表达与定位

李建平，吴素芳，李健宇，香 巴 (1.吉林农业科技学院 动物科技学院,吉林 吉林市 13109；.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 13006)

毛色由黑色素细胞产生的真黑色素(黑色/棕色)和褐黑色素(黄色/红色)的数量和比例决定[1]。绒山羊作为一种特种经济动物，其生产的绒、肉和奶与人们生活息息相关。羊绒被纺织业誉为“纤维宝石”[2]，但绒山羊毛色相对较少，不能满足纺织业及消费者的需求，因此，近年来有关绒山羊毛色形成机制的研究逐渐增多，特别是影响黑色素合成的色素基因研究。miRNA是一类内源性、非编码、参与转录后调控的RNA分子，通过结合mRNA的3′UTR或开放阅读框调节基因表达，在细胞增殖、迁移、分化及疾病发生等过程中发挥着重要作用。研究表明，miR-370可抑制肝癌发生，是潜在的治疗靶点[3]。此外，miR-370还可通过靶向EGFR调节胃癌细胞的增殖和分化，EGFR通常在胃癌中高表达，因而被作为胃癌的筛查指标[4]。miR-370还可通过与circRNA结合促进胃癌细胞内质网应激引起的细胞凋亡[5]。本课题组前期研究发现miR-370与毛囊发育及雄激素性脱发有关，而且在不同毛色皮肤中差异表达[6]，但其是如何通过作用色素基因调控动物毛色的仍不清楚。

Wnt家族由19个高度保守的分泌糖蛋白组成，参与多种细胞过程，如增殖、迁移和自我更新[7]。Wnt信号通路分为经典的Wnt/β-catenin信号通路和非经典的Wnt信号通路[8]，其中Wnt3a通过经典的Wnt/β-catenin信号通路在黑色素细胞的发育中发挥重要作用，可促进黑色素的合成[9]。研究显示，缺乏Wnt1和Wnt3a的突变小鼠几乎完全没有黑色素细胞[10]。体外研究发现，Wnt1和Wnt3a缺失的神经嵴细胞成为神经元而非黑素细胞[11]，而经Wnt3a处理可使其分化成为黑色素细胞而非神经元和胶质细胞[12]。ZHAO等[13]发现microRNA-27a-3p通过靶向Wnt3a抑制小鼠皮肤黑色素细胞的黑色素生成。

KITLG是KIT基因的配体，在造血、黑色素生成和配子生成中起重要作用[14]。KITLG/KIT通路在黑色素合成中的作用，不仅包括成黑素细胞和黑素细胞的迁移，还能维持出生后皮肤的黑色素生成[15]，在毛囊上皮细胞中表达的KITLG对黑素细胞的终末分化起重要作用[16]。KIT突变会导致花斑病的形成，患者在腹侧和/或骶部皮肤表面出现无色斑症状[17]。

本试验选取miR-370为研究对象，通过qPCR和免疫组化技术分析miR-370、Wnt3a和KITLG在不同毛色绒山羊皮肤组织中的表达、分布及相互关系，为人工调控动物毛色奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 样本采集随机选取白色和棕色绒山羊各3只，在肩胛部采集皮肤组织，立即置入液氮保存。

1.2 主要试剂和器材TRIzol裂解液、qPCR试剂盒、木瓜蛋白酶、SP(兔IgG)-POD Kit、Mayer’s苏木素染液购自北京索莱宝生物科技公司；乌贼墨购自中国药品生物制品检定所； Wnt3a、KITLG抗体购自沈阳万类生物科技有限公司；台式微量冷冻离心机、TG16-W微量离心机购自赛默飞世尔科技公司；冰冻切片机CM1950购自德国LEICA公司；电热恒温水槽DK-80型购自上海一恒科技有限公司。

1.3 不同毛色绒山羊皮肤黑色素含量测定取绒山羊皮肤组织剪碎，加入木瓜蛋白酶和蒸馏水，55℃水浴加热16 h，离心后弃去上清，再依次经石油醚、无水乙醇和蒸馏水清洗，烘干得到皮肤样品。称取2 mg的乌贼墨，溶解在0.1 mol/L NaOH中，使其终质量浓度为200 mg/L，在80℃的水浴中加热使其溶解。制备黑色素标准曲线：在酶标板中加入配制好的乌贼墨，200 μL/孔，使各孔的质量浓度分别是0，20，40，60，80，100，120，140，160，180，200 mg/L，每孔加入200 μL制备好的皮肤样品，放入酶标仪并检测波长500 nm处吸光度值，并根据测得的结果绘制黑色素标准曲线，计算样品的黑色素浓度及皮肤组织黑色素含量。

1.4 不同皮肤组织miR-370和靶基因的表达TRIzol裂解法提取组织RNA后进行反转录与荧光定量分析。反转录按照试剂盒说明书操作，总体系为20 μL，反应条件：37℃，5 min；42℃，60 min；70℃，5 min。qPCR反应体系：10 μL 2×FastStart Essential DNA Green Master，1 μL cDNA，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。qPCR反应条件：95℃预变性10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，35个循环。miR-370和靶基因分别采用U6和GADPH作为内参(引物序列见表1)。

表1 引物信息

1.5 Wnt3a和KITLG在白色和棕色绒山羊皮肤的分布将皮肤组织取出，包埋后切片，展片后用丙酮固定，PBS清洗3次，每次4 min，滴加3% H2O2，室温避光放置10 min，蒸馏水洗3次，滴加封闭液，室温30 min后甩去液体，加入Wnt3a(1∶200)和KITLG(1∶200)抗体，对照组加入PBS，4℃孵育过夜。用PBS洗涤3次，每次2 min，加入Biotin标记的羊抗兔IgG工作液(1∶100)，室温孵育30 min，PBS洗涤后滴加DAB显色液，置于显微镜下观察和控制反应时间，蒸馏水洗涤终止反应，滴加苏木素进行轻度复染，用自来水冲洗返蓝，常规脱水、透明、甩干，用中性树胶封片后显微镜下观察结果。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0 进行统计学分析，并进行t检验(P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异)。

2 结果

2.1 白色和棕色绒山羊皮肤组织中miR-370的表达为检测miR-370与绒山羊毛色形成的相关性，采用qRT-PCR检测了miR-370在白色和棕色绒山羊皮肤组织中的表达，结果如图1所示，棕色绒山羊皮肤组织中miR-370的表达显著高于白色绒山羊皮肤组织(P<0.05)。

图1 白色和棕色绒山羊皮肤组织中miR-370的表达

2.2 白色和棕色绒山羊皮肤组织中的黑色素含量为检测白色和棕色绒山羊皮肤组织中黑色素含量的差异，采用NaOH裂解法测定了两种毛色绒山羊皮肤组织中的黑色素含量，结果如图2所示，棕色绒山羊皮肤组织的黑色素含量极显著高于白色绒山羊皮肤组织的黑色素含量(P<0.01)。

图2 白色和棕色绒山羊皮肤组织中黑色素含量

2.3 Wnt3a和KITLG 在白色和棕色绒山羊皮肤组织中的表达采用qRT-PCR法检测了miR-370的靶基因(Wnt3a和KITLG )在白色和棕色绒山羊皮肤组织中的表达，结果如图3所示，棕色绒山羊皮肤组织中Wnt3a和KITLG的表达均显著高于白色绒山羊皮肤组织。

图3 Wnt3a、KITLG在白色和棕色绒山羊皮肤中的表达

2.4 Wnt3a和KITLG在白色和棕色绒山羊皮肤组织中的分布采用免疫组化方法测定了不同毛色绒山羊皮肤组织中Wnt3a和KITLG的分布，结果显示，Wnt3a、KITLG在绒山羊皮肤组织的表皮和内、外根鞘均有表达，在棕色绒山羊皮肤组织的毛乳头也有表达(图4，5)。但不同被毛颜色绒山羊Wnt3a和KITLG表达水平不同，在白色绒山羊中，Wnt3a和KITLG染色呈弱阳性(图4A，C)，而在棕色绒山羊中，Wnt3a和KITLG染色呈强阳性(图5A，C)，对照组未见阳性染色(图4B，5B)。

A，C.分别为Wnt3a、KITLG在白色绒山羊皮肤的表达；B.对照组。1，2，3，4分别为基底层、内、外根鞘和毛乳头图4 Wnt3a和KITLG在白色绒山羊皮肤组织中的分布(10×)

A，C.分别为Wnt3a、KITLG在棕色绒山羊皮肤的表达；B.对照组。1，2，3,4分别为基底层、内外根鞘和毛乳头图5 Wnt3a和KITLG在棕色绒山羊皮肤组织中的分布(10×)

3 讨论

黑色素细胞通过产生黑色素在皮肤和头发色素沉积中发挥关键作用，它们起源于神经嵴的黑素母细胞，在胚胎发生过程中迁移到表皮和毛囊中[18]。黑色素细胞在黑色素小体中合成黑色素，然后将黑色素颗粒转移到相邻的角质形成细胞，最终积聚生成有色皮肤或不同颜色的毛发[19]。本研究通过酶解法提取皮肤黑色素，以NaOH溶解法测定黑色素含量[20]，发现棕色绒山羊皮肤的黑色素含量显著高于白色绒山羊皮肤黑色素含量，这一结果与HU等[21]发现黑色獭兔皮肤黑色素含量多，而白色獭兔皮肤黑色素含量少的结果一致，表明深色皮肤中黑色素含量较多。

研究人员通过检测黑素细胞靶向的Dct-LacZ转基因小鼠，发现Wnt3a蛋白在毛囊发育的生长期，在表皮、隆起处、内根鞘前体细胞和毛球细胞(包括黑素细胞和黑色素干细胞)高表达；在退行期，Wnt3a的表达逐渐下降，仅表达在隆起处；在休止期，毛囊内未见Wnt3a蛋白表达；当毛囊发育进入下一个生长期时，Wnt3a蛋白再次在毛球和黑素细胞中表达[9]。研究人员通过免疫组化检测了Wnt3a在羊驼皮肤组织中的表达，发现Wnt3a广泛表达于毛球、根鞘和表皮，且高表达于棕色羊驼皮肤[22]。本研究也发现Wnt3a在绒山羊皮肤组织的表皮、毛乳头和内、外根鞘表达，且在棕色绒山羊皮肤组织中高表达，表明Wnt3a参与动物毛发颜色的形成。

据报道，KITLG在黑素细胞的终末分化中起关键作用，为头发色素沉积所必需[14]。KITLG及其受体KIT的变异会导致色素沉积的改变。在人类，KITLG基因的编码序列变异已被证明可导致家族进行性色素沉积，伴有或不伴有色素沉积，以及2型阿斯瓦尔登堡综合征(伴有色素异常)。在对过表达miR-137的转基因小鼠的研究中发现，通过抑制KITLG/KIT信号通路中KIT和TRP-2的表达可抑制小鼠黑色素细胞的黑色素合成[23]。研究发现在绒山羊和水貂中，浅色动物的KITLG表达低于深色动物[24-25]。本研究发现KITLG表达于表皮、内、外根鞘和毛乳头，且在棕色绒山羊皮肤中表达量较高，表明KITLG在毛色形成中发挥重要作用。

综上，本研究通过分析miRNA-370和靶基因在绒山羊皮肤的表达及分布，发现Wnt3a、KITLG在绒山羊皮肤组织的表皮和内、外根鞘及棕色皮肤组织的毛乳头有表达；miR-370在棕色绒山羊皮肤中的表达量及黑色素含量均高于白色绒山羊，表明miR-370可能通过正调控靶基因Wnt3a、KITLG从而作用于绒山羊毛色的形成。本研究为阐明绒山羊毛色形成机制奠定了科学的理论基础。