早孕期蜕膜免疫细胞谱及其与妊娠结局的相关性

马静文，王琳琳，张燕，武娅娅，陈聪，吴娟花，连若纯，杨菁*，李龙飞*

(1.武汉大学人民医院生殖医学中心，湖北省辅助生殖与胚胎发育医学临床研究中心，武汉 430060；2. 深圳中山泌尿外科医院生殖中心，深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，深圳中山生殖与遗传研究所，深圳 518045；3.深圳中山泌尿外科医院妇产科，深圳 518045)

受精卵着床后，子宫内膜间质增殖再分化形成蜕膜组织，其结构与功能的正常对妊娠的建立和维持具有重要的意义[1]。胚胎携带有一半母方一半父方的基因，对于母体来说是一种独特的同种异型移植物。在正常妊娠过程中，胚胎得以在母体子宫中存活发育而不发生免疫排斥反应有赖于母胎界面特殊的免疫耐受机制[2]。位于母胎界面的蜕膜组织内的免疫细胞在维持母体对胎儿的免疫耐受中起着重要的作用，妊娠前后免疫细胞谱的变化使得各类免疫细胞共同参与了妊娠的维持，而免疫微环境的失调则会导致妊娠失败甚至发生流产。

本研究通过免疫组织化学法对正常黄体中期内膜、人工流产患者蜕膜及稽留流产患者蜕膜中各类免疫细胞标志物进行检测，初步观察各类免疫细胞标志物于妊娠前后的变化及与妊娠结局的关系，以期描绘出妊娠早期免疫细胞谱及免疫微环境改变对妊娠结局的影响，为临床妊娠免疫失衡的预防和治疗提供理论依据。

资料与方法

一、研究对象

选取2017年9月至2018年9月在深圳中山泌尿外科医院妇科收治的17例稽留流产患者(稽留流产组)、34例行人工流产的正常早孕患者(人工流产组)及同期于本院生殖医学中心治疗且首个IVF周期试孕成功的27例女性(正常内膜组)为研究对象。

诊断标准：(1)稽留流产(超声诊断标准)：头臀比≥7 mm，未见胎心搏动；宫内妊娠囊平均直径≥25 mm，未见胚胎；宫内妊娠未见卵黄囊，2周后仍未见胚胎及胎心搏动；宫内妊娠可见卵黄囊，11 d后仍无胎心搏动。(2)人工流产：符合早孕诊断标准并自愿终止妊娠；符合人工流产术手术指征。

纳入标准：(1)所有患者年龄20～40岁，流产组(人工流产组和稽留流产组)妊娠时间5～12周；(2)各组宫腔形态正常，无子宫畸形、粘连等器质性疾病；(3)无全身感染性疾病，取样前3个月无任何用药史，流产组均无自然流产及死胎史。排除标准：(1)有复发性流产病史；(2)有家族遗传及系统性疾病等；(3)流产胚胎检测有染色体异常。

二、研究方法

1.子宫内膜及蜕膜的收集：(1)子宫内膜：月经周期第10天起，尿LH及B超结合监测排卵情况，排卵后第7～8天利用子宫内膜取样器(Gynetics，Belgium，比利时)刮取少量子宫内膜组织，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗去除组织表面血污。(2)蜕膜：患者行常规消毒、麻醉后取膀胱截石位，多普勒彩色超声确认孕囊位置后行扩宫处理，在腹部B超的引导下，负压吸引妊娠囊行刮宫术。将所得胚胎组织投入95%酒精中固定待病检，分离蜕膜组织后待固定。

2.固定及包埋：将处理好的内膜/蜕膜组织于10%中性福尔马林固定液固定4～6 h，将固定好的组织置于组织盒中放入全自动组织脱水机行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡及包埋待测。

3.免疫组化检测：石蜡包埋的子宫内膜及蜕膜组织做4 μm厚度的切片，按照显色试剂盒(Leica，美国)操作说明，运用自动免疫组织化学仪(Leica，Bond ΙΙΙ，美国)进行免疫组织化学染色实验。具体实验步骤如下：常规梯度脱蜡后，采用3%的过氧化氢试剂封闭内源性过氧化物酶15 min，10%的胎牛血清封闭20 min以阻断非特异性染色；EDTA或柠檬酸抗原修复液进行微波加热处理，采用如下一抗(表1)：CD56、CD68、CD83、CD8、Foxp3、CD1a 37℃孵育1 h后，加鼠、兔通用二抗37℃孵育30 min；再滴加DAB工作液显色，至棕黄色时停止染色，苏木素复染后氨水返蓝，进行梯度酒精脱水，树胶封片。

表1 抗体情况

4.免疫组化实验结果判定：本研究采用Vectra自动病理成像定量分析系统(Perkin Elmer，美国)定量分析子宫内膜及蜕膜组织中各免疫细胞数量。首先低倍镜扫描完整的切片，然后在高倍视野下(放大倍数×200)随机采集30张图像。使用InForm多光谱图像分析软件进行图谱的光谱分析，准确测定各类不同的信号。根据每个免疫靶标的着色不同，对不同玻片的染色进行不同的光谱拆分，训练软件自动识别每个视野中的组织区域、空白区域，并计数组织区域内的所有的子宫内膜或蜕膜细胞及阳性细胞。最后，选取组织区域所占面积超过80%全视野的20张图像纳入统计分析。将阳性细胞率定义为阳性免疫细胞数/子宫内膜或蜕膜细胞总数×100%，最终计算这20张图像的阳性免疫细胞率的平均值作为该免疫细胞的阳性率。

三、统计学分析

结 果

一、患者一般资料比较

本研究共纳入78例患者，其中正常内膜组27例，人工流产组34例，稽留流产组17例。正常内膜组：平均年龄(31.6±4.2)岁；自然黄体中期。人工流产组：平均年龄(32.2±6.5)岁；孕周5～9周，平均孕周(6.3±1.0)周。稽留流产组：平均年龄(33.8±4.6)岁；孕周6～9周，平均孕周(6.8±0.7)周。各组患者间一般资料均无统计学差异(P>0.05)。

二、子宫内膜及蜕膜组织中免疫细胞的数量变化

1.妊娠前后免疫细胞谱的变化：在人工流产组中，CD56+细胞、CD68+细胞及CD83+细胞这3类免疫细胞数均高于正常内膜组，差异均具有统计学意义(P<0.001)；而CD8+细胞、Foxp3+细胞和CD1a+细胞这3类免疫细胞数与正常内膜组相比均无显著变化(P>0.05)(图1、表2)。

正常内膜组为黄体中期内膜组织，人流/稽留组均为孕7周蜕膜组织。A：CD56+阳性细胞率；B：CD68+阳性细胞率；C：CD83+阳性细胞率；D：CD8+阳性细胞率；E：Foxp3+阳性细胞率；F：CD1a+阳性细胞率。红色箭头所示为阳性细胞。组间比较，*P<0.05，#P<0.01，†P<0.001图1 不同组间子宫内膜及蜕膜各类免疫细胞阳性率比较

表2 正常内膜组与人工流产组间子宫内膜/蜕膜组织各免疫细胞阳性细胞率比较(%)

2.稽留流产对妊娠免疫细胞谱的影响：稽留流产组蜕膜组织中CD68+细胞、CD8+细胞和Foxp3+细胞数均高于人工流产组，差异有统计学意义(P<0.05)；而CD56+细胞、CD83+细胞和CD1a+细胞数均无显著性变化(P>0.05)(图1、表3)。

表3 人工流产组与稽留流产组组间蜕膜组织各免疫细胞阳性细胞率比较(%)

三、蜕膜免疫细胞数量随孕周的变化

以人工流产组蜕膜免疫细胞数为基准观察蜕膜免疫细胞随孕周的变化情况，其中孕5周检测4例、孕6周20例、孕7周5例、孕8周3例、孕9周2例。对于CD56+细胞、CD68+细胞和CD83+细胞，孕5周开始显著上升(P<0.05)后在5～9周未有明显数量变化，其中CD83+细胞在孕9周又有明显上升；对于CD8+细胞，孕8周开始显著上升(P<0.05)后保持恒定数量；对于Foxp3+细胞，早孕期蜕膜中数量无显著变化(P>0.05)；对于CD1a+细胞，早孕期蜕膜中数量在孕9周显著下降(P<0.05)(图2)。

不同孕周与黄体中期比较，*P<0.05，#P<0.01，†P<0.001图2 早孕期蜕膜各类免疫细胞变化趋势

讨 论

妊娠早期的蜕膜化子宫内膜构成了母胎界面的重要成分，在维持妊娠的过程中，母胎界面大量的免疫细胞参与了母体免疫耐受的调节作用，使得胚胎在植入过程以及后续的妊娠过程中不被母体所排斥[3]。妊娠期母体子宫内膜的免疫细胞数量和功能会发生很大的变化，具体表现为免疫排斥的减弱和保护反应的增强，使母体与胎儿之间处于一种免疫平衡的状态，有助于更好的维持妊娠[4]。而这种免疫平衡的状态一旦被打破则会产生不良的妊娠结局。

CD56是一种神经细胞粘连因子，主要表达在所有的NK细胞、少部分的细胞毒性T淋巴细胞及一部分神经组织中[5]。它是NK细胞重要的表面标志物。在本研究中，在妊娠早期，NK细胞在母胎界面大量聚集，成为最主要的免疫细胞，在胚胎植入这一关键时期大量出现的NK细胞究竟扮演着什么样的角色呢？蜕膜NK细胞是以分泌转化生长因子-β(TGF-β)为主的NK3细胞[6]。TGF-β能够诱导子宫内膜发生蜕膜样变化，使滋养层向无侵蚀性的合体滋养层细胞分化；蜕膜NK细胞还能产生金属蛋白酶抑制剂和纤溶酶原启动抑制因子，借此调节金属蛋白酶和纤溶酶的活性，抑制滋养层细胞的过度侵蚀；除此之外，蜕膜NK细胞还能分泌IFN-γ，在蜕膜化过程中发挥着对血管分化与生长的调控作用。这些机制使得胎儿组织能够不被母体所排斥，维持了母体对半同种异体胎儿的耐受性[7]。妊娠早期增多的NK细胞在维持母胎免疫耐受中发挥着重要的作用。

巨噬细胞是母胎免疫耐受的核心细胞之一，它可通过识别耐受胚胎抗原从而直接影响妊娠结局，CD68是巨噬细胞表面重要的标志分子[8]。本研究中，蜕膜巨噬细胞成为第二大主要聚集的蜕膜免疫细胞。蜕膜巨噬细胞是子宫中重要的抗原提呈细胞，主要分布在子宫螺旋动脉外膜和血管壁中，有研究证实，在子宫螺旋动脉重塑的过程中，巨噬细胞先于初期滋养层细胞聚集于子宫螺旋动脉周围[9]。在重塑过程中，蜕膜巨噬细胞能够及时吞噬清除发生凋亡的血管平滑肌细胞和滋养层细胞碎片，防止炎性物质释放到周围组织引起炎性反应影响胚胎的发育。除了重要的吞噬作用来保护子宫组织环境，蜕膜巨噬细胞还能够分泌多种细胞因子，包括与免疫调节有关的细胞因子：IL-1、IL-10和TNF-α，与血管生长相关的细胞因子：血管生成素、各类基质金属蛋白酶，这些细胞因子在免疫应答、代谢与修复、血管生成等方面发挥着重要的作用[10]。虽然大量增多的巨噬细胞在维持母胎免疫耐受发挥重要作用，但我们的结果发现，稽留流产组患者蜕膜巨噬细胞数量相较于人工流产患者组有明显的上升，与Svensson-Arvelund等[11]的研究中流产患者中巨噬细胞增多并活化导致流产的结果相一致。这些结果表明，妊娠早期母体巨噬细胞在子宫局部过多的激活和浸润可能是导致自然流产和子痫前期等病理性妊娠的重要原因，但其具体机制仍有待进一步研究。

除了上述两种重要的免疫细胞，树突状细胞在妊娠维持中也起着重要的作用，不仅能介导母体对外来抗原产生防御性免疫应答，更能介导蜕膜对胚胎的免疫耐受。在本研究中，将CD83作为成熟树突状细胞的标志物，CD1a作为未成熟树突状细胞的标志物来检测两类树突状细胞的表达情况，我们发现，成熟的树突状细胞在早孕期显著增加，而未成熟树突状细胞无显著变化。有研究显示蜕膜树突状细胞与子宫蜕膜血管生成有关[12]。Blois等[13]的研究显示，接种树突状细胞能够减少妊娠小鼠的自然流产发生率，但其确切的调节机制有待深入研究。而在小鼠的围植入期去除树突状细胞时，子宫部分蜕膜出现分化缺陷，植入过程受损，植入位点的血管减少，基质细胞增生缺陷，胎盘发育受损及妊娠失败[13]。所以在妊娠时母胎界面大量出现的成熟蜕膜树突状细胞可能在胚胎植入及妊娠维持中发挥着重要的作用。

除了上述免疫细胞外，蜕膜中还有一定量的T细胞发挥着重要的作用。在妊娠早期，一方面CD8+T细胞表现为暂时性细胞毒性功能障碍，有益于免疫耐受的维持[14]；另一方面，在滋养层细胞的刺激下，蜕膜CD8+T细胞高表达Tim-3、CTLA-4或PD-1，使其具有高增殖性，从而分泌大量的IL-4和IL-10等细胞因子，对母胎耐受维持具有积极的作用[15]。在Lachapelle等[16]的研究中，复发性流产人群患者蜕膜中CD8+T细胞数量明显减少，这进一步证明CD8+T细胞对于妊娠维持具有重要作用。然而在本研究中，稽留流产患者组中CD8+T细胞数量却显著上升，这与Galgani等[17]在正常人群和复发性流产患者对照研究中的结果一致，复发性流产患者蜕膜中CD8+T细胞数量显著增加。表明过多的CD8+T细胞可能也会带来不良妊娠结局。不同的检测人群、样本量的大小及实验环境等差异可能会造成以上相悖的结论，蜕膜CD8+T细胞对于复发性流产及稽留流产患者的影响还需要更深入的研究。

除了CD8+T细胞在稽留流产患者组中显著上升，以Foxp3+为表面标记的Treg细胞的数量也显著增加。Treg是一类调节性T细胞[18]，于妊娠早期迅速升高，能够释放TGF-β、IL-10等细胞因子来抑制滋养层细胞的凋亡，诱导子宫螺旋动脉重塑及胎盘的发育，在母胎免疫耐受及早期妊娠维持中发挥着重要作用[19-21]。早在2004年，Sasaki等[22]的研究就初次报道了Treg细胞与自然流产的关系，他们发现自然流产患者外周血和蜕膜中的Treg细胞数显著低于人工流产患者组，并提出流产的发生可能与Treg细胞数量增加不足有关；近年来的研究也显示，不明原因复发性流产患者蜕膜的Treg细胞数显著低于正常女性组[23]。然而本研究得出了相反的结论，稽留流产组相较于人工流产组患者蜕膜Treg细胞数显著上升。另外，Treg细胞可能与来源于同一细胞系的Th17细胞协同参与妊娠的维持。研究发现，Th17/Treg细胞的平衡在其中发挥着重要的作用[24]。Th17/Treg细胞失衡将诱导其他免疫细胞分泌IL-22、γ-干扰素及TNF-α等免疫杀伤因子，影响正常的胎盘细胞的分化生长，最终使滋养层细胞发育异常，母体对胚胎产生排斥作用，导致流产[25]。本研究中仅研究了Treg细胞数量在稽留流产组中的变化，不能全面反映Th17/Treg细胞平衡状态的变化，有待进一步对Th17细胞相关标志物进行测定，探究Th17/Treg细胞平衡与流产的关系。

综上所述，妊娠早期，子宫蜕膜中大量增加的NK细胞、巨噬细胞及成熟树突状细胞均在母胎免疫耐受及妊娠的维持中发挥着重要的作用。了解早孕期子宫蜕膜免疫细胞谱能够更好地理解生殖免疫在妊娠的建立和维持中发挥的作用。其中，稽留流产患者组中显著增加的CD68+巨噬细胞及CD8+T细胞可能与自发流产有关，这可能与免疫耐受机制被破坏有关，其具体机制还需要深入的研究。对于Treg细胞的分析，需要加入同一源系的Th17细胞来综合探讨Th17/Treg细胞之间的平衡对于自发流产的影响。本研究采用的全自动免疫组织化学仪器及自动病理成像定量分析系统已应用于临床免疫细胞分析，从标本的收集制备蜡块到实验及数据分析已形成系统化的平台[26-27]，相较于流式细胞学技术，除了可以进行定量各免疫细胞，更方便定位这些免疫细胞表达位置是否存在差异。但由于本研究所选取的稽留流产组样本并未在胎停的时刻进行取样，受到机体本身免疫防御的影响，可能会对免疫细胞的数量产生影响；除此之外本研究中样本量较少，人工流产患者多在早孕期检测出妊娠阳性时选择进行手术，对于孕周较大的样本取样困难，需要进一步扩大样本量来进行大样本的对照研究，描绘出更为全面、可信度更高的早孕期蜕膜免疫细胞谱。