血液氨基酸浓度与IVF-ET周期妊娠结局的相关性分析

李萍萍，初国铭，谭季春*

(1.中国医科大学附属盛京医院生殖医学中心，沈阳 110022；2.辽宁省生殖障碍疾病与生育力重塑重点实验室，沈阳 110022；3.中国医科大学附属盛京医院临床遗传科，沈阳 110004)

随着医学研究和技术的不断进步，辅助生殖技术(ART)已成为治疗不孕症的主要方法[1]。2016年，我国实施的IVF周期超过90万个，分娩新生儿30万例[2]。越来越多的不孕症患者期待通过ART治疗获得妊娠，然而仍有一部分患者的IVF周期结局并不理想。探索相关影响因素对于预测IVF治疗结局或给予相应的干预措施具有重要的指导意义。影响IVF周期生殖结局的风险因素是多方面的。英国国家健康护理优化研究院(The National Institute for Health and Care Excellence，NICE)临床指南推荐将女性年龄、既往ART治疗次数、既往妊娠史、体重指数和生活方式因素用于预测IVF结局，还提出胚胎移植数量、卵巢储备(抗苗勒管激素水平、窦卵泡数、FSH水平等)、不孕年限、不孕原因、获卵数和可移植胚胎数对预测IVF结局也有重要的价值[3]。近年来，一些其它影响因素如空气污染物[4]、炎症因素[5-6]、生殖道菌群[7]等相继被发现与IVF结局密切相关。

已有研究显示，IVF周期妊娠组与未妊娠组胚胎培养基中的氨基酸水平存在显著差异，胚胎培养第3天的培养基中丙氨酸水平与胚胎移植后妊娠结局负相关[8-9]；而妊娠并发症(妊娠期糖尿病或妊娠期高血压)女性血液氨基酸代谢水平也发生了显著改变[10]，提示氨基酸代谢与妊娠相关的胚胎发育和母体健康息息相关。本研究拟通过对本中心不孕症患者IVF-ET后验孕日的血液氨基酸代谢组学进行分析，以明确影响IVF结局的氨基酸种类，为IVF的治疗和结局预测提供参考。

资料和方法

一、研究对象

选择2020年4月至2020年8月在中国医科大学附属盛京医院生殖中心接受IVF-ET治疗、并参与中国人群辅助生殖人口及子代队列建立与应用基础研究项目的100例患者作为研究对象。

纳入标准：IVF-ET周期。排除标准：验孕日未在本中心留取外周血样。本研究通过中国医科大学附属盛京医院伦理委员会审批(伦理批号2017PS269K)；所有患者均签署知情同意书。

二、研究方法

1.分组：根据胚胎移植后约2周(验孕日，第11～15天)进行血β-HCG测定的验孕结果和移植后28～35 d超声验孕结果，将患者分为妊娠组(β-HCG≥2.90 U/L，且超声显示妊娠囊和妊娠囊内见胎心、胎芽)和未妊娠组(β-HCG<2.90 U/L或超声未见妊娠囊、胎心、胎芽)。

2.氨基酸代谢组学分析：通过液相色谱-串联色谱技术(Liquid chromatography tandem chromatography，LC-MS/MS)检测18种血液氨基酸的浓度，干血滤纸片经含氨基酸内标的甲醇萃取，盐酸正丁醇衍生后，利用液相色谱-串联质谱仪进行检测，质控标本采用美国疾控中心提供的标准滤纸片，利用已知内标的浓度计算出所测氨基酸浓度。进一步将与妊娠结局相关的氨基酸按浓度高低进行分组分析，同时分析妊娠组患者血β-HCG水平与氨基酸浓度的相关性。

3.促排卵及IVF-ET：所有患者的控制性促排卵方案及IVF-ET均按照本中心常规治疗及操作规程进行。

4.观察指标：收集所有患者的一般资料，包括年龄、体重指数(BMI)、不孕年限、基础FSH水平、抗苗勒管激素(AMH)水平、周期数、HCG日/转化日内膜厚度、不孕病因、周期类型、促排卵方案、内膜准备方案、移植的胚胎数量和胚胎质量、血β-HCG水平等数据。卵裂期优质胚胎的定义为8～10细胞I级或II级的D3～D4胚胎，囊胚期优质胚胎定义为Gardner囊胚评分AA/AB/BA/BB的胚胎。

三、统计学分析

结 果

一、患者一般资料

本研究共纳入100例IVF-ET助孕治疗的不孕症患者，根据妊娠结局将患者分为妊娠组(63例)和未妊娠组(37例)。两组患者间年龄、基础FSH值、AMH水平、移植胚胎数和胚胎类型均具有显著统计学差异(P<0.05)，妊娠组患者的年龄更小、基础FSH水平更低、AMH水平更高、移植胚胎数更少、HCG日/转化日内膜厚度更厚、囊胚移植比例更高；两组患者间BMI、不孕年限、促排卵方案、内膜准备方案和移植胚胎质量均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 患者一般资料比较[(-±s)，n(%)]

二、两组患者血液氨基酸浓度比较

妊娠组患者血液中瓜氨酸的浓度显著低于未妊娠组，而谷氨酰胺和丝氨酸的浓度显著高于未妊娠组(P<0.05)，其它氨基酸浓度均无统计学差异(P>0.05)(表2)。由于妊娠组囊胚移植比例高，因此进一步将所有患者分为卵裂期胚胎移植组和囊胚移植组，分析两个亚组患者氨基酸水平的差异，结果发现两个亚组患者间血液氨基酸浓度均无显著差异(P>0.05)。

表2 患者血液氨基酸浓度(μmol/L)比较(M[P25，P75])

三、血液氨基酸浓度与妊娠结局之间的相关性

单因素Logistic回归分析表明，血液瓜氨酸浓度越低、谷氨酰胺和丝氨酸浓度越高，妊娠的概率越高(P<0.05)。在校正了年龄、BMI、不孕年限、基础FSH水平、AMH值、移植的胚胎数量、HCG日/转化日内膜厚度、不孕病因和移植胚胎类型等混杂因素后，多因素Logistic回归分析表明，瓜氨酸浓度仍与妊娠呈负相关，而丝氨酸浓度与妊娠呈正相关(P<0.05)(表3)。

表3 血液氨基酸浓度与妊娠结局的Logistic回归分析

进一步根据血液瓜氨酸和丝氨酸浓度三分位分组后，分析氨基酸浓度与妊娠结局的相关性。结果表明：与低浓度组相比，瓜氨酸高浓度组获得临床妊娠的概率降低71.9%；而丝氨酸中等浓度组获得临床妊娠的概率是低浓度组的2.65倍，高浓度组获得临床妊娠的概率是低浓度组的2.415倍(表4)。

表4 血液瓜氨酸和丝氨酸浓度分组与妊娠结局的相关性分析

由于妊娠组与未妊娠组血液β-HCG水平具有显著差异，我们初步分析了妊娠组患者血液β-HCG水平与不同氨基酸浓度的相关性。线性回归分析表明，血液β-HCG水平与丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸浓度负相关，与精氨酸浓度正相关(P<0.05)；在校正了混杂因素后，多元回归分析表明血液β-HCG水平与丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸浓度负相关，与精氨酸浓度正相关(P<0.05)(表5)。

表5 血液氨基酸浓度与临床妊娠患者血β-HCG值相关性分析

进一步将妊娠组患者根据血液β-HCG水平三分位分组，分成低[24.00～658.94 U/L)、中[658.95～1 918.67 U/L)、高[1 918.68～4 264.00 U/L)3个水平组，分析β-HCG水平与氨基酸浓度的相关性。结果表明：高水平β-HCG和低水平β-HCG患者血液丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸和谷氨酸浓度均无显著差异(P>0.05)；与β-HCG中水平组相比，β-HCG低水平组丙氨酸、谷氨酸浓度均显著升高(P<0.05)(表6)。

表6 临床妊娠患者血液β-HCG水平与氨基酸浓度的相关性分析

讨 论

氨基酸对胎儿生长非常重要，而母体血液氨基酸的浓度是影响胎儿氨基酸供应的重要因素之一，当胎儿氨基酸供应中断可能导致胎儿生长受限或巨大儿。一项荟萃分析表明，补充精氨酸家族的氨基酸可改善合并妊娠疾病有妊娠并发症孕妇的胎儿出生体重，降低高危人群分娩小于胎龄儿的风险[11]。代谢组学检测可以反映生物体、器官和细胞的内在或外在相互作用，胚胎培养液的氨基酸代谢作为评价胚胎发育和预测妊娠结局的参考指标，已经越来越多地见诸于辅助生殖领域研究中。研究者发现在校正其它混杂因素后，胚胎培养液中甘氨酸和丙氨酸浓度仍与妊娠结局呈负相关，提示两者与胚胎活力有关[8]。通过数学建模表明，丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸和丙氨酸的氨基酸色谱图峰高和峰面积组合对于妊娠组和非妊娠组的预测率分别达到82.7%和95.7%[12]。卵泡液的氨基酸代谢组学变化也可为复发性流产患者提供诊断依据和治疗靶点[13]。已发现，复发性流产患者血液赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、组氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸显著增加，这些氨基酸代谢物的改变可能与过度炎症反应和血管功能障碍有关，从而导致子宫内膜容受性差[14]。然而，血液氨基酸谱的变化如何影响IVF妊娠结局尚未确定。本研究结果提示女性血液中瓜氨酸的浓度与IVF妊娠结局呈负相关，丝氨酸的浓度与IVF妊娠结局呈正相关。

瓜氨酸是一种非必需氨基酸，由小肠中的谷氨酰胺和脯氨酸内源性转化产生。瓜氨酸在肾脏中被吸收并转化为精氨酸，然后释放到全身血液中[15]。在瓜氨酸转化为精氨酸的过程中，一氧化氮合酶介导了血管扩张剂一氧化氮的生成。正常妊娠过程中，由子宫动脉内皮合成的一氧化氮可增加通过动脉的血流量，以满足胎儿日益增长的营养需求。妊娠期过量饮酒可影响瓜氨酸生物合成和代谢相关的特定途径，可能是酒精诱导的子宫动脉功能障碍的潜在机制[16]。我们推测在胚胎植入阶段，较低浓度的母体瓜氨酸可能通过调节子宫内膜的血流影响胚胎的着床过程。丝氨酸也是一种非必需氨基酸，是糖酵解途径的中间产物。丝氨酸具有多种有益作用，它是大脑功能和发育的重要营养素，能促进神经元的生长[17]。一项随访4年的队列研究发现，血液丝氨酸水平与代谢综合征的发展和血脂异常呈负相关[18]。本研究发现丝氨酸具有有益妊娠的作用，与这些前期报道相符。一项针对反复种植失败女性的血液代谢物分析亦发现精氨酸代谢途径受损[19]，提示我们有必要深入探索精氨酸代谢途径调控胚胎植入的具体分子机制，从而为一些不明原因妊娠失败患者提供新的治疗靶点。

此外，本研究尚存在一些不足之处，有待未来在大样本研究中进一步改进：(1)本研究纳入的对象为所有的验孕患者，应设立严格的排除标准，保证研究人群的均一性，从而明确影响血液氨基酸水平的相关因素；(2)研究的样本量较小，无法得出瓜氨酸或丝氨酸浓度作为预测IVF妊娠结局的临界值。