烟曲霉肺部感染的免疫逃逸作用机制研究进展

严唯 林时辉 幸宇 徐昉

(1.重庆医科大学附属第一医院重症医学科，重庆 400016；2.重庆医科大学基础医学院法医学教研室，重庆 400016)

曲霉菌属腐生真菌[1]，现已经成为免疫功能低下患者致病性感染重要病原菌。全球因血液系统疾病、遗传免疫缺陷或实体器官移植等相关免疫抑制所致的侵袭性曲霉菌病(invasive aspergillosis，IA)已超过200 000例/年[1-2]。曲霉菌感染可以引起IA、过敏性哮喘(allergic asthma)、过敏性支气管肺曲霉菌病(allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA)以及支气管哮喘或囊性纤维化的并发症等[3]。烟曲霉(Aspergillusfumigatus)是IA最常见病原体，侵袭性烟曲霉病是造成重症免疫受损患者死亡主要原因之一。烟曲霉可以通过过敏反应、非侵入性定植到威胁生命的侵入性感染起的肺组织破坏。尽管近年来通过更好的诊断和治疗方法IA患者的预后得到改善，但其发病率和死亡率仍然很高，尤其是在免疫缺陷的患者中[4]。烟曲霉经吸入进入宿主体内后，其通过诸如干扰宿主免疫反应、控制或逃避等复杂免疫逃逸机制，最终穿透组织屏障以实现在宿主体内传播。此时，宿主体内保护性免疫与致病微生物免疫逃避间存在一种微妙的平衡。而这一平衡的倾斜方向取决于宿主对抗微生物、病原体对抗/抑制或逃避宿主免疫防御两方面的能力。现总结近年来烟曲霉在肺部感染中的免疫逃逸和组织侵袭的相关研究，并探讨其作用机制。

1 烟曲霉侵袭性感染的致病基础

现已发现的344种曲霉属中有近20种对人类具致病作用[5]，烟曲霉是重要致病病原体[6]。烟曲霉菌落呈暗烟绿色绒状或絮状，广泛分布于土壤、空气等有机环境。烟曲霉致病性包括烟曲霉细胞壁成分和色素生成、参与免疫逃逸、营养吸收的组分、通过改变代谢增加毒力信号分子的各类水解酶等，并借此可参与细胞信号传导过程中各种分子及其结构蛋白间的复杂相互作用[7]。烟曲霉细胞壁的主要由β-葡聚糖、几丁质、半乳糖胺半乳聚糖 (galactosaminogalactan，GAG)和α-葡聚糖组成[8]，与真菌发病机制和毒力密切相关[9]，也是重要的病原相关模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。分生孢子是烟曲霉通过空气传播的主要形态[10]，平均大小为2～3 μm，室内外环境浓度范围为1～102/m3，可高达108/m3[11]，较黄曲霉、黑曲霉等更能深层侵入肺泡。分生孢子细胞壁外层是由黑色素所构成，可为烟曲霉提供抗紫外线辐射的保护，以维持细胞和孢子基因组稳定性[12]。分生孢子可通过被宿主吸入下呼吸道、侵入呼吸道上皮细胞后的发育生长发育成菌丝、菌丝侵袭血管等过程造成全身性感染[13]。中性粒细胞或吞噬细胞减少症患者[14-15]，难以通过自身免疫反应阻止吸入的烟曲霉孢子或菌丝生长，导致肺部烟曲霉感染甚至多系统感染[16]。烟曲霉的致病成分还包括其产生的多种次级代谢产物，例如胶霉毒素(gliotoxin，GT)、烟曲霉素(fumagillin)、烟曲霉酸(helvolic acid)、烟曲霉毒素A(fumitremorgin A)和烟曲霉溶血素[15]等。研究表明，GT由NRPS催化的丝氨酸和苯丙氨酸氨基酸的缩合反应产生，烟曲霉96%的毒力作用由其引起[17]，其可通过启动局部或普遍免疫抑制机制，促进真菌生长并在宿主组织内定殖。烟曲霉素是烟曲霉在菌丝发育期间产生的另一重要毒素，其通过与蛋氨酸氨基肽酶2(MetAP-2)共价相互作用，促进菌丝生长抑制活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，抑制中性粒细胞功能和血管生成[18]。此外，烟曲霉还可以产生如过氧化氢酶、碱性蛋白酶、金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶等多种蛋白酶，促进组织黏附和穿透作用，提高侵入宿主能力并抵御机体免疫反应。可见，烟曲霉具有多种毒力结构/成分，参与其在肺部感染中的侵袭。

2 肺部烟曲霉感染与免疫逃逸

病原微生物黏附宿主细胞同时也要适应肺部环境压力，并通过逃避免疫反应而持续存在[19]。烟曲霉可逃避免疫系统识别，绕过宿主抗真菌防御机制，以提高自身生存机会[20]。其免疫逃逸机制涉及产生或获取组织破坏酶、黏附与定植、适应宿主体内环境压力、逃避补体监视以及下调宿主炎症反应抑制作用等。

2.1 肺烟曲霉感染后的黏附、定植作用

分生孢子细胞表面覆盖由RodA疏水蛋白所组成的小棒层，可通过建立刚性框架限制多肽链的移动性[21]，使其具有疏水性和防水性，利于在空气中扩散。分生孢子进入肺部后引起炎症反应使表皮受损，孢子表面层黏连蛋白受体与表皮下基底膜上层黏连蛋白结合，使烟曲霉更易定植[22]。烟曲霉表面的黏液细胞外基质也有助分生孢子黏附于基质[23]。同时，其细胞壁成分GAG亦是菌丝有效黏附宿主细胞表面并保护真菌细胞壁免受免疫识别所必需的重要成分[24]。此外，分泌丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等蛋白水解酶可降解宿主结构屏障，促进侵袭能力，增强烟曲霉毒性[25]。

2.2 烟曲霉对机体内环境压力的适应

烟曲霉细胞壁成分会因其不同形态(休眠、膨胀或发芽)、所处不同外部生存环境(pH值、低氧等)而发生改变[26]。烟曲霉在感染进程中已逐步形成抵抗温度、pH值、水平衡、氧化损伤和抗真菌宿主分子等压力的机制[27]。烟曲霉能在高达55℃下生长，并可承受70℃环境温度[28]，耐热性相关基因thtA、afpmt1、crgA和ireA在烟曲霉耐热机制中发挥作用。其中，afpmt1转录甘露糖基转移酶，负责48℃下的烟曲霉生长；crgA可编码核糖体生物发生蛋白；ireA则编码内质网、网状跨膜传感器蛋白[7]。这些耐热机制可作为体内应激反应一部分而被激活，有助其在宿主体内生存。研究表明，烟曲霉定植于肺部并持续生存的环境中氧气浓度偏低，烟曲霉不仅可适应这一低氧环境[29]，还可抑制血管生成而导致肺缺氧，进一步阻止受损组织新血管形成[30]。活性氧(reactive oxygen species，ROS)被认为是抵抗烟曲霉重要宿主防御反应，但烟曲霉侵入过程中会产生过氧化氢酶[31]、超氧化物歧化酶[32]、抗氧化剂硫氧还蛋白[33]、谷胱甘肽[34]及其相关酶以抵抗ROS作用[35]。而烟曲霉对pH值变化则并不特别敏感，酸、碱性条件下均可生长。

2.3 烟曲霉免疫逃逸中的营养摄取

营养可用性与可吸收性是真菌感染宿主细胞基本要求[36]。烟曲霉富含大量蛋白酶[37]，可以从蛋白质降解中获取碳，因而其生长并不需任何特定碳源[38]。肺部主要的蛋白质是胶原蛋白和弹性蛋白，蛋白酶可降解肺组织蛋白质并提供碳、氮获取所必需氨基酸[39-40]。烟曲霉含大量蛋白酶和肽酶，以及氨基酸转运蛋白编码基因，以确保从外源蛋白质底物中释放和吸收氨基酸，烟曲霉可以通过多种调节机制来确保氮的摄取[41]。烟曲霉AreA型GATA因子可以与其他转录因子相互作用，来响应细胞内谷氨酰胺水平[42]。缺乏GATA因子的烟曲霉毒性也会比正常曲霉菌株低[43]。铁是细胞生物学过程必需营养素，在烟曲霉毒力维持、糖异生、蛋白磷酸酶活性、细胞壁完整性等中均发挥作用。而烟曲霉缺乏铁排泄机制，因而需要控制铁吸收、代谢以调节铁稳态。烟曲霉不能直接利用血红素、铁蛋白或转铁蛋白等铁源，铁载体介导的铁吸收和高亲和力还原铁同化(reductive iron assimilation,RIA)是目前证实的两种自身供铁机制[44-45]。而铁代谢受HapX(抑制铁消耗途径)和SreA(抑制铁载体系统)两个主要转录因子调节[46]。细胞内铁蛋白和铁载体对于烟曲霉毒力也至关重要。细胞内、外铁载体不足都会使毒力部分减低[47]。若完全消除铁载体生物合成会则可使小鼠模型侵袭性肺烟曲霉绝对无毒性[48]。锌对真菌生长也是必不可少的，烟曲霉必须使用锌转运蛋白(zinctransporters，ZNTs)进行代谢[49]。更为重要的是，ZafA和ZrfC样蛋白仅在真菌间分布，是特定真菌靶标[50-51]。ZafA基因缺失会损害烟曲霉生长和发芽功能[52]，锌螯合化合物则会抑制其生长[50-51]。此外，ZafA还可上调烟曲霉zrfC和aspf2表达，影响铁摄取和麦角固醇生物合成、氧化应激适应性反应及次级代谢产物产生等基因的表达[53]。

2.4 烟曲霉对宿主补体监视的逃避

宿主对微生物的早期防御之一是补体激活，介导感染性病原体的吞噬。烟曲霉分生孢子定植肺部后会受到宿主补体系统攻击。在补体激活时宿主细胞也会通过一系列调节剂来控制和防止补体对自身细胞的攻击，利用这一方面，烟曲霉已进化出控制宿主补体攻击的逃逸策略[54]。其分生孢子色素1,8-二羟基萘(DHN)黑色素可防止C3结合[55-56]。烟曲霉色素合成关键基因——alb1失活使烟曲霉色素缺失，孢子与补体C3结合增强，易于被吞噬细胞所识别吞噬[56]。同时，真菌丝氨酸蛋白酶Alp1可裂解并降解人补体蛋白C3、C4和C5，使真菌从补体攻击中逃脱[57]。烟曲霉进入机体后亦可利用可溶性人血浆调节剂[包括因子H、H样蛋白1(FHL-1)、C4b结合蛋白(C4BP)和纤溶酶原]来限制补体沉积[54]。其分生孢子表面表达的Aspf2既是锌稳态调节蛋白[58-59]又是纤溶酶原结合与补体调节剂获得表面蛋白，可与因子H、FHL-1和FHR1结合蛋白，并抑制人嗜中性粒细胞调理/吞噬作用，有助真菌免疫逃逸。Aspf2结合纤溶酶原使其转化为活性纤溶酶，利用宿主活性蛋白酶纤溶酶破坏人肺上皮细胞，改变细胞代谢活性，并诱导细胞收缩，导致上皮下细胞外基质暴露，增强真菌侵袭力[60]。Aspf2敲除则使烟曲霉更有效与C3b发生作用，并被吞噬[60]。

2.5 下调宿主炎症反应抑制抗烟曲霉作用

烟曲霉生物膜的调节作用 烟曲霉生物膜可保护真菌免受免疫反应杀伤，并增强其对抗真菌物质的抵抗力。烟曲霉分生孢子表面共价结合到细胞壁上的疏水性RodA蛋白组成棒状层，可避免被免疫系统识别并使其具有免疫惰性，从而抑制树突状细胞或肺泡巨噬细胞成熟/激活，并失去对Th细胞免疫应答的激活能力[61]。细胞壁GAG成分有利于曲霉菌感染发展[62]，极具侵略性，甚至在免疫能力正常小鼠中也能促进其生长。GAG可通过诱导白介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)来抑制人或小鼠Th1和Th17细胞因子产生[24,63]，也能通过诱导细胞凋亡和对中性粒细胞胞外捕获物(neutrophil extracellular traps，NETs)的抗性能以减少中性粒细胞募集，增加侵袭性曲霉病易感性[63]。

烟曲霉次级代谢产物的调节作用 烟曲霉的次级代谢产物同样具有极强免疫抑制作用，可协助真菌适应不同环境条件，提高其物种竞争力或抑制免疫反应[64]。烟曲霉合成的DHN-黑色素[65]是其借以逃避免疫监视的主要工具。黑色素可降低紫外线对烟曲霉的影响，维持基因组稳定性[12]。其亦能减少细胞吞噬作用和降低杀灭微生物肽毒性[66-68]。同时，黑色素还可提高烟曲霉对ROS、抗真菌药物和细胞裂解的抗性[7]。而DHN-黑色素则能阻断吞噬溶酶体，并且诱导PI3K/Akt激酶直接磷酸化，使分生孢子可通过阻止胱天蛋白酶活化而抑制巨噬细胞凋亡途径[69]。

次级代谢产物GT是一种免疫抑制性的真菌毒素[70]。GT可通过抑制肌酸激酶、NADPH氧化酶等以改变宿主防御系统。其能阻止NADPH氧化酶复合物组装与活性，抑制中性粒细胞呼吸爆发[71]；其也可通过直接灭活蛋白硫醇来抑制巨噬细胞和多形核细胞功能[71-72]，抑制对分生孢子的吞噬作用[73]，以促进体内真菌传播。GT亦可通过抑制NF-κB信号途径，破坏宿主促炎反应[74]。GT还能作用于细胞产生的活性氧损伤DNA，诱导凋亡性细胞死亡。

烟曲霉素则可促进菌丝生长，抑制了ROS生成[18]，且具有抗血管生成活性，能促进真菌侵袭破坏肺上皮细胞[75]。其还有抑制中性粒细胞功能和诱导红细胞死亡等作用[76]。烟曲霉酸则属于一类天然类固醇抗生素，可以影响巨噬细胞功能，还会引起上皮细胞的纤毛化和破裂[77]。核糖毒素(ribotoxin)属灭活核糖体的碱性蛋白，可通过催化灭活核糖体抑制蛋白质合成。Aspf1是一种核糖毒素，与过敏性曲霉疾病有关[78]。

烟曲霉诱导Th2相关免疫损伤 Th2在烟曲霉感染期间似乎起非保护作用，尤其在与真菌分泌蛋白质相互作用后更为明显。在曲霉感染中Th2不仅抑制保护性免疫，且是引起过敏反应的关键因素。Th2细胞通过抑制促炎细胞因子和趋化因子，抑制T细胞活化和IFN-γ表达并促进Th2反应，从而对曲霉病的保护性Th1反应产生负面影响[79]。烟曲霉刺激支气管上皮细胞后，还能激活蛋白酶受体(PAR-2)和PTPN11(SHP2)，这种磷酸酶亦可抑制IFN-γ信号传导，使得CD4+T细胞偏向Th2细胞反应[80]。动物模型中已证实，过度的Th2反应与曲霉病不良预后相关[81]。

综上所述，烟曲霉的结构与其致病因子复杂多样，面对机体免疫反应烟曲霉已开发出多种免疫逃逸策略以提高自身在宿主体内的生存率。其在“恶劣”的环境中形成了补偿机制和途径来抵消不利于自身生存的环境因素，这种能力可以帮助真菌抵抗宿主的防御，造成宿主的肺组织破坏性感染。烟曲霉可以通过黏附/定植、适应内环境压力、改变营养摄取、逃避宿主补体监视和下调宿主抗真菌反应等方式来逃避宿主的炎症反应，这也使烟曲霉感染更具侵袭性、难治性。随着免疫功能低下患者人数的增加，烟曲霉肺部感染数量也将会持续增长。了解真菌病原体与宿主间复杂的免疫串扰将是研究真菌感染发生机制和治疗标靶的核心内容，为从抗宿主免疫层面探讨烟曲霉新的治疗方法提供了更广阔前景。