头颈部特应性皮炎患者面部马拉色菌的菌种分布

林洁 杨连娟 杨名珍

(1.上海市宝山区仁和医院皮肤科，上海 200431；2.上海同济大学医学院附属上海市皮肤病医院皮肤科，上海 200050；3.宁夏回族自治区银川市贺兰县人民医院药剂科，宁夏 750200)

特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)，是一种与遗传体质有关的慢性炎症性皮肤病[1]，其中头颈部AD是一种亚型，好发于头面部、颈部和躯干上部，在青少年和成人中多见[2]。相比白念珠菌，嗜脂酵母马拉色菌的致敏作用对头颈部AD病情进展更重要[3]。传统的培养和生理生化分析鉴定方法周期长，影响因素较多，故我们用qPCR(quantitative real-time PCR)方法检测了头颈部AD患者面部皮损区和非皮损区的7种马拉色菌DNA的拷贝数量，以了解头颈部AD患者面部马拉色菌的菌种构成[4]。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2020年9—12月上海市宝山区仁和医院和上海市皮肤病医院皮肤科门诊就诊的AD患者共45例，符合头颈部AD诊断标准[5]。病情严重程度采取湿疹面积及严重程度指数评分法：<7分为轻度，7～21分为中度，>21分为重度[6]。其中轻度AD：男7例，女20例，平均年龄23.7岁；中度AD：男9例，女6例，平均年龄22.8岁；重度AD：男3例，女0例，平均年龄28.7岁。50名健康对照者均来自上海市宝山区仁和医院工作人员及其子女，男24例，女26例，平均年龄21.9岁。研究的两组对象在年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院医学伦理委员会批准，两组研究对象均签署知情同意书。

纳入标准 ①符合头颈部AD诊断标准；②面部均有皮损区和非皮损区；③能配合检测者。

排除标准 ①2周内使用抗真菌药物和糖皮质激素史；②采样前2 h进行洗浴；③伴有其他皮肤病；④伴有恶性肿瘤及其他严重疾患。

1.2 采样

用一次性无菌棉签拭子采集头颈部AD患者面部皮损区和非皮损区及健康对照者面颊部的皮肤鳞屑，每个区域以相同的力度擦拭相同面积的皮肤(3 cm×3 cm)3次[4]。

1.3 DNA的提取

采集健康对照者面颊部、AD患者面部皮损区和非皮损区的皮肤鳞屑样本，按照陆茂等[7]的方法提取马拉色菌基因组DNA，记录取样面积，用于计算单位面积拷贝数。

1.4 引物的设计和合成

糠秕马拉色菌(M.furfur)、球形马拉色菌(M.globosa)、钝性马拉色菌(M.obtusa)、厚皮马拉色菌(M.pachydermatis)、限制马拉色菌(M.restricta)、斯洛菲马拉色菌(M.sloofiae)、合轴马拉色菌(M.sympodialis)等7种马拉色菌序列下载自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，通过比对分析找到各个菌种的特异性序列，设计引物(见表1)。

表1 本实验用到的qPCR引物序列

1.5 马拉色菌标准质粒的构建与验证

不同马拉色菌特异性引物先进行PCR扩增，电泳后切胶回收目的片段，将回收产物连接到pTG19-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有IPTG和x-gal的琼脂糖平板筛选阳性克隆，跳取单菌落，对阳性质粒进行测序验证。对测序正确的质粒，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，测定浓度，计算拷贝数。并将质粒DNA进行10倍梯度稀释，进行qPCR实验。

1.6 PCR反应

反应体积20 μL，其中正反向引物各0.4 μL，SYBR Green Realtime PCR Master mix 10 μL，基因组DNA 1 μL，补去离子水至20 μL。反应程序：95℃预变性4 min；94℃变性10 s，60℃退火延伸40 s，循环40次；采集溶解曲线。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 头颈部AD患者面部皮损和非皮损区7种马拉色菌DNA拷贝数量的比较

健康对照者面部、患者面部皮损和非皮损区7种马拉色菌的DNA拷贝数量结果见表2。结果显示：M.restricta的平均拷贝数在3组中都是最高的，显著高于其他6个；其次是M.globosa、M.sloofiae、M.sympodialis，3者平均拷贝数接近；其他的菌种平均拷贝数很少，均小于20×104/cm2。

表2 头颈部AD患者面部皮损、非皮损和健康对照者马拉色菌DNA平均拷贝数比较(×104/cm2)

与健康对照者相比，患者面部皮损区M.globosa、M.restricta、M.pachydermatis、M.obtusa和M.furfur的平均拷贝数比健康对照者显著增加。而非皮损区与健康对照者面部的马拉色菌菌种构成与拷贝数无明显差异。

2.2 头颈部AD患者面部皮损区马拉色菌DNA平均拷贝数和病情严重程度的相关性

7种马拉色菌在患者皮损不同程度下DNA平均拷贝数见图1。结果显示，M.globosa和M.restricta平均拷贝数随病情严重程度而增加，在轻度与中度、中度和重度之间均有统计学意义，P<0.05。

图1 轻重程度不同的皮损患者不同马拉色菌拷贝数分析(×104/cm2). A. M. furfur； B. M. globosa; C. M. obtusa; D. M. pachydermatis; E. M. restricta; F. M. slooffiae; G. M. sympodialis(*：P<0.05；**：P<0.01)

3 讨 论

马拉色菌是一种条件致病菌，为人类及温血动物皮肤上的常驻菌群。其含脂酶，能把脂质分解为脂肪酸，提供自身代谢必需的营养，故主要寄生于人体皮脂腺丰富的头面部等，目前发现有18种，传统的分型有7种[8]。人体皮脂分泌量出生3个月时经历第一阶段高峰，儿童期减少，青春期再次增加，直到50岁[9]。因此，年龄在马拉色菌的皮肤定植中起着重要作用，本文随机入选的头颈部AD患者和健康对照组年龄为20～30岁，以年轻人为主。

研究发现，与健康对照组和其他部位AD患者相比，头颈部AD患者的皮肤点刺试验(SPT)和马拉色菌特异性IgE阳性率更高[3]。AD的发病机制目前普遍认为是在遗传基础上由免疫、环境、感染、皮肤屏障缺陷等多因素作用而发病[1]。马拉色菌过敏可能是一个触发因素，AD患者皮肤屏障缺陷增加了皮肤免疫系统与皮脂溢出部位马拉色菌的接触机会，从而诱发了细胞介导的免疫反应，以及马拉色菌特异性IgE的产生，反过来加重了AD的皮损[10]。

然而，目前没有直接证据表明AD患者马拉色菌定植更为严重，马拉色菌在头颈部AD患者面部的菌种构成报道也有差异，可能与人种、生活地区及检测方法有关[11-12]。传统的培养鉴定报道以生长较快的糠秕马拉色菌定植为主，近年基因测序、qPCR等分子生物学方法发现AD患者皮肤马拉色菌主要由球形或限制马拉色菌构成，占80%以上[13,7]，并且马拉色菌属占所有真菌的63.2%～72.7%[14]。本研究结果显示：限制马拉色菌在头颈部AD患者和健康人的面部都是优势菌种，DNA平均拷贝数高于其他6个菌种约5倍以上，皮损区比非皮损区、健康对照高约3倍以上；其次，球形马拉色菌虽然不是健康者面部的优势菌种，但是皮损区的平均拷贝数显著高于健康者约7倍，非皮损区和健康者之间无统计学意义。结果提示限制和球形马拉色菌与头颈部AD的皮损明显相关，与上述文献报道一致。并且，本研究结果还显示限制和球形马拉色菌拷贝数量随病情严重程度而增加，重度>中度>轻度，三者间均有统计学意义(P<0.05)，与Akaza[15]和Kaga[13]的报道一致，但是国内冉玉平教授[7]报道28例儿童(0～12岁)AD患者面部皮损区、非皮损区马拉色菌属拷贝数与EASI评分无相关性，可能是青春期前皮脂分泌量少的原因。总之，我们的结果和文献显示AD患者面部皮损处以限制和球形马拉色菌为主，并且随皮损严重程度定植数量增加，但两者与疾病严重程度之间的因果关系以及在头面部AD中特异性的发病模式有待更多进一步的研究。

此外，我们结果还显示厚皮、糠秕和钝性马拉色菌的平均拷贝数比健康者也增加，虽然总体拷贝数量不高，提示AD面部皮损区马拉色菌的菌种数量较健康者面部更丰富。由此提醒临床医师，当AD患者出现头颈部病变、青春期或年轻人病情加重、或者常规抗炎治疗抵抗或加重等情况，要考虑马拉色菌过敏可能，可选择给予抗真菌治疗。