环状RNA在子宫内膜异位症中的表达及意义〔1〕

陈美红，张晓玲

(江西省妇幼保健院，江西 南昌 330006)

子宫内膜异位症(EMs)是妇科常见病，常出现慢性盆腔痛、痛经、不孕、异常阴道流血等临床症状，严重影响广大妇女的生活质量[1]。随着高通量测序技术的发展，许多新的生物信息学方法应用于临床疾病的生物学诊断。最近研究发现环状RNA(circRNA)在许多疾病中发挥重要作用，故本文通过高通量测序技术研究circRNA在EMs中的表达情况及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月—2018年12月我院妇科住院的子宫内膜异位症患者4 例为观察组，年龄20～45 岁；同期在我院妇科门诊行常规妇科检查患者4 例为对照组，年龄20～45 岁。两组患者月经周期规律；术前6 个月无甾体类激素治疗史。纳入标准：经腹腔镜手术及术后病理检查诊断为子宫内膜异位症；患者均知情同意并经医院伦理委员会批准。排除标准：妇科恶性肿瘤及其他部位恶性肿瘤、心脑血管等重要器官疾病；妊娠期或哺乳期。

1.2 方法

用抗凝管采集患者静脉外周血5～10 mL，混匀，离心10 min，分离出血浆成分，分装至冻存管，放置-80 ℃冰箱保存备用。提取血浆中的RNA，并测定其浓度及纯度。用总RNA文库预试剂盒(Illumina)实现了构建测序文库的RNA预处理，使用Agilent 2100生物分析仪进行质量控制和量化，然后在Illumina Hi-Seq2500测序系统进行测序，通过分析，得到高质量的circRNA表达量。

1.3 统计学方法

用R语言软件包(version 3.6)对circRNA的表达量进行标准化及处理，找出两组之间circRNA表达的差异，用热图表示出结果，fold change≥2和P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

通过高通量测序技术，共得到363 个circRNA在观察组及对照组之间差异有统计学意义，其中有192 个高表达的circRNA和171 个低表达的circRNA。用热图表示差异性circRNA的相对表达量(见图1)。通过比较，找到6个表达显著的差异性circRNA的相对表达量，其中低表达的circRNA有：has-circRNA-001808，has-circRNA-402533，has-circRNA-405971。高表达的circRNA：has-circRNA-000881，has-circRNA-406655，has-circRNA-023016(见图2)。

深色代表circRNA相对高表达，浅色代表circRNA相对低表达量图1 两组circRNA表达热图

圆点表示在观察组的表达量；正方形表示在对照组的表达量，***代表P<0.001，**代表P<0.01，*代表P<0.05。control为对照组；treat为观察组图2 6个差异性circRNA在两组的相对表达量

3 讨 论

EMs是指子宫内膜组织(腺体和间质)异位在子宫体以外的部位，主要包括盆腔脏器和壁腹膜，如卵巢、子宫骶韧带、肠管等部位。EMs虽是良性疾病，但具有发病率高、复发率高、治疗效果欠佳等特性，全球约1.76 亿妇女遭遇该疾病的折磨[2]。迄今为止，EMs的病因学及发病机制尚不明确，包括经血逆流学说、遗传因素[3]、免疫因素[4]、炎症[5]、类肿瘤疾病[6]等。研究表明[7]，EMs具有恶性肿瘤相似的生物学行为，如细胞侵袭、迁移、局部扩散、远处转移等。circRNA是1976年发现的一类特殊的非编码RNA，与传统的线性RNA不同，circRNA的3＇和5＇端共价结合，形成共价闭合连续环，具有组织特异性及高度保守性[8]。由于其特殊的生物结构，核酸外切酶无法将其降解，故circRNA比多数线性RNA具有更加稳定性的生物学功能。circRNA序列高度保守，具有组织特异性和发育阶段特异性。它能作为miRNA“海绵”功能，充当miRNA的受体，抑制miRNA活性及致miRNA靶基因水平升高，参与肿瘤细胞的调控、增殖及侵袭[9]，如肺癌[10]、胃癌[11]、胰腺癌[12]等恶性肿瘤组织中发现差异性circRNA的表达情况。有学者[13-14]采取EMs患者在位内膜及异位内膜组织样本进行circRNA微阵列分析及qRT-PCR验证，发现5 个circRNA (circ-0004712，circ-0002198，circ-0003570，circ-0008951和circ-0017248)和8个mRNA(SCN3B，ENTPD1，IL16，BACH2，C3，CKS2，G0S2，PGRMC1) qRT-PCR的结果与微阵列结果相符，并构建了circRNA-miRNA-mRNA网络，揭示癌症相关的主要作用嘌呤代谢、甘油磷脂代谢、甲状腺激素信号通路在EMs发病中的作用。Zhang等[15]通过微阵列检测正常内膜、EMs在位内膜及异位内膜的circRNA表达情况，发现2 237个差异性circRNA，8 个circRNA可能是参与上皮-间质转化过程。另外Wang等[16]也通过对EMs在位内膜组织及异位内膜组织相比较，发现146个上调circRNA及148个下调circRNA，可能参与EMs的发生发展。以上研究报道均通过对患者的组织标本进行测序，而均未对外周血的circRNA进行高通量测序。本文通过对EMs患者静脉外周血进行高通量测序，发现有363 个差异性表达的circRNA，其中有192 个高表达的circRNA和171 个低表达的circRNA，并找到6个表达显著的circRNA的表达量，其中has-circRNA-001808，has-circRNA-402533及has-circRNA-405971呈现低表达；has-circRNA-000881，has-circRNA-406655及has-circRNA_023016呈现高表达。通过研究比较发现血液中的circRNA与组织的circRNA的表达量有些相同，具体原因有待于进一步研究。

目前有不少对于circRNA作为RNA家族成员的研究，虽然命名了很多种circRNA，但只有少数circRNA的生物学功能及机制得到确定，大部分仍然处在研究初期。与其他类型的内源性RNA相比，circRNA具有高度保守、结构稳定、表达量高、稳定性强、与miRNA结合位点多等优点。随着高通量测序技术的进步，circRNA的检测越来越方便。circRNA可以分泌到细胞外环境，在组织、血液、体液中能检测出circRNA。关于circRNA在EMs的病因学及发病机制研究才刚起步，仅发现几种与EMs相关的circRNA，circRNA可能作为EMs的诊断标志物，我们下一步将通过qRT-PCR验证circRNA高通量测序结果，并进行生物学功能及信号通路分析，为EMs的发病机制提供一定的帮助。