清肺通络方对肺炎支原体肺炎小鼠体内氧化应激的影响

宋 瑶,姜永红,姜之炎,赵晓阳,肖 臻

(上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)

肺炎支原体是介于细菌和病毒之间的最小病原微生物，能够在无细胞培养基上独立存活，是能够引发呼吸道感染的常见病原体。肺炎支原体可通过飞沫传播，进入人体后可有2～3周的潜伏期，继而呈现相关的临床症状，严重者会发展为肺炎支原体肺炎，也会有大约1/3的人成为无症状的肺炎支原体携带者。肺炎支原体肺炎患者临床表现主要以发热、咳嗽为主，也有畏寒、头痛、遍体不适等症，病程在1～3周。支原体肺炎好发于3岁以上儿童及青年人，有地区流行的特点。目前关于肺炎支原体肺炎致病的具体机制仍不十分明确，主要包括呼吸道上皮黏附[1-2]、肺炎支原体直接侵犯细胞及免疫功能紊乱[3]等，氧化应激引起的肺损伤与肺炎支原体肺炎的发生发展有重要关系[4]。近年来，随着大环内酯类药物耐药性报道逐渐增多[5],寻找新型治疗药物迫在眉睫。项目组前期研究发现，中药清肺通络方能够通过调控 NLRP3炎症小体，改善免疫炎症反应，并抑制细胞凋亡[6]。本研究以氧化应激反应为切入点，通过构建肺炎支原体肺炎小鼠模型，探讨在氧化应激和炎性反应的途径中，中药清肺通络方治疗肺炎支原体肺炎的作用，从中药中找寻治疗肺炎支原体肺炎的新思路和方法。

1 实验材料与方法

1.1动物 BALB/c小鼠100只，3周龄，体重(18±2)g。由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(沪)2013-0016，合格证编号：20130016010285，检疫后备用。SPF级动物房，雄性分笼饲养，空白组与感染组隔离饲养，自由摄取标准颗粒饲料和水，适应3 d后开始实验。

1.2药品 阿奇霉素干混悬剂(辉瑞制药有限公司，国药准字J20050062)；清肺通络方采用中药免煎颗粒剂(四川新绿色药业科技发展股份有限公司)，购自上海中医药大学附属龙华医院，方药组成：桑白皮9 g、地骨皮9 g、桃仁9 g、矮地茶9 g、杏仁9 g、紫苏子9 g、葶苈子9 g、甘草3 g。小鼠用药剂量换算采用Bios氏公式，将100 mg阿奇霉素溶于10 mL蒸馏水，小鼠用量为0.25 mL/20 g；清肺通络方每包中药需水体积27.6 mL，小鼠用量0.25 mg/20 g。

1.3主要试剂 肺炎支原体国际标准株 FH(美国 ATCC 公司提供，产品号： ATCC15531)；一氧化氮合酶(NOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；肺炎支原体核酸检测试剂盒(Cat.#DA-D064，达安基因)。

1.4实验方法 将100只小鼠随机分为正常组、模型组、清肺通络方组、阿奇霉素组、中西医结合组，每组20只。正常组给予 0.9%氯化钠50 μL/次早晚滴鼻，其余组给予支原体国际标准株(将存储在-80 ℃冰箱中混于等体积20%甘油冻存的肺炎支原体离心，分离甘油，加入无菌水后反复吹打，作为工作菌液备用)50 μL/次(含1×107ccu/mL)早晚缓慢滴入鼻腔使其进入气管支气管，其中前1～3 d滴鼻造模，后8～10 d再次滴鼻造模。造模第1天开始，正常组和模型组给予生理盐水0.25 mL/20 g连续灌胃10d；清肺通络方组给予清肺通络方0.25 mL/20 g连续灌胃10d；阿奇霉素组给予阿奇霉素药液0.25 mL/20 g灌胃，第1～3天和第8～10天；中西医结合组给予阿奇霉素药液0.25 mL/20 g灌胃，第1～3天和第8～10天，同时给予清肺通络方0.25 mL/20 g连续灌胃10 d。

1.5检测指标及方法 实验第6天、第11天每组每次各处死小鼠10只，摘眼球取血，8 000 r/min离心，取上清备测；灌洗左肺，回收灌洗液；取右侧肺组织3 mm×3 mm×3 mm，余置于10%福尔马林中保存。

1.5.1肺组织切片病理观察 小鼠肺组织样本包埋与固定后，常规HE染色，封固保存，用显微镜拍照并采集分析样本相关部位。

1.5.2肺组织中肺炎支原体DNA含量PCR法检测 阴性质控制品制备，取样本匀浆至完全裂解离心，加入提取液混匀，取2 μL样品裂解后的上清液离心；将肺炎支原体阳性定量的参考品离心；具体PCR扩增步骤按照ABI 7300扩增仪的标准操作程序进行。数据分析采用ABI Prism 7300 SDS Software。

1.5.3氧化应激指标检测 生化法检测小鼠肺泡灌洗液、肺组织、血清中NOS、iNOS、NO、MDA、SOD表达水平，检测步骤和计算方法按照检测试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1各组小鼠肺组织病理表现 正常组小鼠肺组织结构基本正常，支气管和肺泡结构未见明显病变，见图1；模型组小鼠支气管黏膜细胞坏死脱落管腔变窄，肺泡壁和间隔有大量炎性细胞浸润，微血管扩张充盈，肺泡壁变厚破坏，见图2；清肺通络方组小鼠支气管管腔变窄较为明显，肺泡壁和间隔有炎性细胞浸润，微血管扩张充盈较为明显，部分肺泡壁变厚明显，见图3；阿奇霉素组小鼠支气管腔变窄较不明显，肺泡壁和间隔有较多炎性细胞浸润，微血管中度扩张充盈，部分肺泡壁变厚，见图4；中西医结合组小鼠支气管管腔变窄不明显，肺泡壁和间隔有少量炎性细胞浸润，微血管轻度扩张充盈，肺泡壁变厚不明显，见图5。

2.2各组小鼠肺组织中肺炎支原体DNA含量 实验第6天和第11天，正常组小鼠肺组织中肺炎支原体DNA含量均为0，模型组均显著增高(P均<0.05)，清肺通络方组、阿奇霉素组和中西医结合组均明显低于同期模型组(P均<0.05)，且中西医结合组明显低于同期清肺通络方组和阿奇霉素组(P均<0.05)；实验第11天与实验第6天比较，中西医结合组小鼠肺组织中肺炎支原体DNA含量明显降低(P<0.05)，其他组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠肺组织中肺炎支原体DNA含量比较

2.3各组小鼠氧化应激指标表达水平 实验第6天和第11天，与正常组比较，模型组小鼠肺泡灌洗液、肺组织、血清中NOS、iNOS、NO、MDA表达水平均明显增高(P均<0.05)，SOD表达水平均明显降低(P均<0.05)。与模型组比较，清肺通络方组、阿奇霉素组和中西医结合组NOS、iNOS、NO、MDA表达水平均明显降低(P均<0.05)，SOD表达水平均明显增高(P均<0.05)。 实验第6天，阿奇霉素组肺泡灌洗液中NOS、NO、SOD表达水平，肺组织中iNOS、NO、MDA表达水平，血清中NOS、MDA表达水平改善情况均明显优于清肺通络方组(P均<0.05)；中西医结合组肺泡灌洗液中NOS、iNOS、NO表达水平，肺组织中iNOS表达水平，血清中NO、MDA表达水平均明显低于清肺通络方组和阿奇霉素组(P均<0.05)，肺泡灌洗液中MDA表达水平，肺组织中NO、MDA表达水平，血清中NOS、iNOS表达水平均明显低于清肺通络方组(P均<0.05)，而各样本中SOD表达水平均明显高于清肺通络方组和阿奇霉素组(P均<0.05)。实验第11天，阿奇霉素组与清肺通络方组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，中西医结合组肺泡灌洗液、肺组织中SOD表达水平均明显高于清肺通络方组(P均<0.05)。见图6～8。

3 讨 论

肺炎支原体能够附着在细胞膜上，将微管插入细胞同时释放过氧化氢和超氧游离基，中性粒细胞和其他细胞可以在炎症反应过程中激活NOS、iNOS，并产生过量的NO，所以氧化应激引起的肺损伤与肺炎支原体肺炎的发生发展有重要关系[7]。研究表明，肺炎支原体肺炎患者外周血单核细胞存在氧化应激反应，当机体遭受外来致病因素侵袭时，中性粒细胞作为机体最主要的活性氧(ROS)来源，其活化产生大量ROS，而SOD广泛参与到急性炎症反应中，含量大幅度降低，当ROS产生多于体内抗氧化系统的抗氧化储备时，氧自由基对肺组织的影响大大增加[8-9]。氧化应激是机体受到各种刺激后体内的氧化与抗氧化作用失去平衡，产生大量氧化产物堆积，致机体损伤的一种病理过程，其中由线粒体产生的ROS在氧化应激中发挥着重要作用[10-11]。氧化应激反应释放过量产生的ROS与脂质、蛋白质、DNA结合发生过氧化反应，通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死，最终引起组织结构与功能的破坏[12-13]。生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为MDA，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。另外氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤[14]。故ROS、MDA、SOD是评价氧化-抗氧化系统的重要指标，其中MDA为评估机体氧化损伤程度的重要依据，SOD可评价机体的抗氧化能力[15]。

肺炎支原体肺炎目前主要采用大环内酯类抗菌药物治疗，方法较为单一且因其耐药性的产生，在很大程度上较为局限。中药及复方有望发挥多靶点、多环节、多层次的作用，对治疗肺炎支原体肺炎具有潜在优势。中医学将肺炎支原体肺炎归属于“肺炎喘嗽”“咳嗽”“咳逆”“风温”等证的范畴。钱乙《小儿要证直绝·变蒸》有云：“五脏六腑，成而未全……全而未壮。”清代吴鞠通提出:“小儿稚阳未充，稚阴未长者也。”从阴阳学说出发，阴是指体内精、血、津液、脏腑、血脉、脑髓、筋骨、肌肤等有形之质，阳是指体内脏腑的生理功能的活动，吴鞠通认为小儿时期脏腑娇嫩，行气未充，卫外不固，易感外邪。对于肺炎，在叶天士提出“温邪上受，首先犯肺”，将其称为风温之后，才归入到温病范畴之中。《临证指南医案·温热》有云：“吸入温邪，鼻通肺络。”鼻为肺之窍，指出温邪可通过鼻窍直侵于肺络，再通过肺络进行传变[16]。肺炎支原体肺炎在于外邪入肺，郁而化热，从而使气机升降受阻，肺络壅滞，清肃之能受损，邪热熏蒸，从而出现发热、咳嗽、咳痰、气促等[16]。本病的基本病机为多种因素导致的“肺络”狭窄，即肺络闭阻、肺失宣肃，具体表现为初因毒邪入肺，瘀而化热，肺气阻滞，气不能运血，血行滞涩，而脉络失养；痰瘀壅阻肺络，导致络虚不荣，虚实夹杂，病情迁延难愈或易反复发作[17]。从病机出发，清肺通络成为本病的治疗关键。中医治疗的根本目的在于调整阴阳，使肺络恢复通畅。治疗上，叶天士提出“络以通为用”和“凡病宜通”的思想，通络之法强调“络以辛为泄”，包括辛温通络、辛苦通络、辛香通络、辛咸通络、辛润通络及虫类通络[18]。对小儿支原体肺炎治法包括祛风、解表、散寒、宣肺、活血、化瘀、清肺、化痰通络等，应根据不同致病因素选用不同治法，但归其目的都是为了疏通络脉，热者清之，痰者涤而畅之，痰瘀互阻化而通之，脉络不足、气阴两虚补而和之[19-20]。

清肺通络方是在儿科经典名方“泻白散”合“苏葶丸”的基础上，以“肺络”理论为指导，结合临床实践组方而成，该方秉承以清肺为基础同时化痰祛瘀通络的理念，从恢复肺络气血供给及运行来改善支原体外邪所致的肺络痹阻，维持正常肺的通气与宣降功能。方中桑白皮为君药、地骨皮为臣药，两者清热泻肺而宣通肺气，肺之“气络”得通，使肺气宣降得利，又治肺之虚热，质润不燥，泻肺而不伤肺，对小儿体质尤为适用；杏仁宣肺平喘，苏子降气化痰，葶苈子泻肺平喘，三药合用可在泻白散的基础上清肃肺气、化痰通络；桃仁活血润肠、止咳平喘，矮地茶止咳化痰、利湿活血，两药配伍可活血化瘀通络，与泻白散相配伍可增降气平喘之效；甘草祛痰止咳，调和诸药。

本实验研究发现，实验第6天，模型组小鼠肺泡灌洗液、肺组织、血清中NOS、iNOS、NO、MDA表达水平明显高于正常组，SOD表达水平明显低于正常组，提示肺炎支原体肺炎小鼠体内出现氧化应激反应；实验第11天，模型组小鼠肺泡灌洗液、肺组织、血清中NOS、iNOS、NO、MDA表达水平继续上升，SOD表达水平继续下降，说明肺炎支原体感染后无药物干预情况下，小鼠体内氧化应激损伤持续加重。实验第6天和实验第11天，清肺通络方组、阿奇霉素组和中西医结合组肺泡灌洗液、肺组织、血清中NOS、iNOS、NO、MDA表达水平均明显低于模型组，SOD表达水平明显高于模型组，提示清肺通络方和阿奇霉素可通过调节小鼠体内氧化反应减轻肺炎支原体对机体造成的炎性损害。实验第6天，阿奇霉素组肺泡灌洗液中NOS、NO、SOD，肺组织中NO、iNOS、MDA，血清中NOS、MDA表达水平降低或升高程度均优于清肺通络方组；实验第11天，阿奇霉素组与清肺通络方组各指标比较均无明显差异。说明阿奇霉素序贯治疗第6～10天中对体内氧化/抗氧化指标的调控效果有所下降，为今后临床减少抗生素的使用提供了新的思考方向。本研究还发现氧化应激指标在肺泡灌洗液、血清中的表达较为显著，在临床上可根据实际需求选择检测标本类型。

综上所述，清肺通络方能够抑制肺炎支原体肺炎小鼠体内NOS与iNOS的活力，有效减少NO、MDA生成，提高SOD活力，起到调节体内氧化/抗氧化系统的作用，从而减轻肺部炎症损伤，且清肺通络方与阿奇霉素联用作用更为显著。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。