施今墨对药配方对2型糖尿病大鼠氧化应激的影响

王雪楠，常 宏，喇孝瑾，马雷雷，李继安

(华北理工大学中医学院,河北 唐山 063210)

2型糖尿病是一种病因复杂、具有遗传易感性、以糖代谢紊乱为主的代谢性疾病。研究显示胰岛素抵抗和活性氧(ROS)过量引起的氧化应激是2型糖尿病发病和并发症产生的主要因素[1],二者相互影响,ROS 产生过多不仅仅是胰岛素抵抗的结果,而且是胰岛素抵抗的一个危险因子。而具有抗氧化性的超氧化物歧化酶(SOD)和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)可通过调节ROS的平衡保护机体免受ROS导致的氧化损伤[2]。课题组前期研究证实,以施今墨对药为主配伍的中药复方具有良好的降糖效果[3]。为此,本实验以氧化应激为切入点,观察施今墨对药配方对2型糖尿病大鼠血糖、血清C肽、游离脂肪酸(FFA)、SOD、MDA和胰岛素抵抗的影响,初步探寻其治疗2型糖尿病的作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 雄性Wistar大鼠,SPF级,体重(180±10)g,购于斯贝福(北京)生物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2016-0002。饲养于华北理工大学中医学院动物实验室，室温20～25 ℃,相对湿度40%～50%。

1.2药物与试剂 施今墨对药配方:按黄连5、肉桂3、葛根3、丹参3、苍术3、生地3、厚朴3、桑白皮5、黄芪3、五味子7.5、菟丝子10、莱菔子10、天花粉3、玄参3的比例配伍。以上中药饮片购于唐山市同仁堂药店,经鉴定为正品。加8倍量水煎煮2 h,将2次药液混合后加热浓缩成混悬液,置于4 ℃冰箱,根据高、中、低剂量和大鼠体重配制成对应剂量混悬液。二甲双胍片(上海施贵宝制药有限公司,AAW6090)。链脲佐菌素(STZ,Sigma-S0130,CAS#18883-66-4);大鼠C肽检测试剂盒(江苏酶标生物,MB-2129A)，SOD检测试剂盒(南京建成,20180912)，FFA检测试剂盒(南京建成,20180907)，MDA检测试剂盒(南京建成,20180912)。

1.3仪器 稳益血糖仪(长沙三诺公司);JJ1000型电子天平(常熟双杰测试仪器厂);Centrifuge 5430R离心机(Eppendorf公司);infinite M200 pro酶标仪(Tecan公司);SK-0180-E圆周摇床(美国Scilogex公司)。

1.4实验方法 50只Wistar大鼠普通料适应饲养1周后,随机选取6只作为正常组,普通饲料饲养,不限食水；余44只参照文献[4-6]方法造模：给予5%葡萄糖饮水+高脂饲料饲养4周,不限食水，之后腹腔注射STZ 35 mg/kg 诱导，以空腹血糖(FPG)≥11.1 mmol/L及餐后2 h血糖(2hPG)≥16.7 mmol/L为成模标准,剔除死亡及未达标大鼠,共成模30只。将30只糖尿病大鼠随机分为模型组、二甲双胍组及施今墨对药配方高、中、低剂量组, 每组6只。按人与大鼠的体表面积比换算成人所用药量[7]，每天8:00，二甲双胍组给予1 g/kg二甲双胍灌胃，施今墨对药配方高、中、低剂量组给予23.2 g/kg、11.6 g/kg、5.8 g/kg施今墨对药配方灌胃,正常组和模型组灌胃等量生理盐水，,每周日8:00称体重并及时调整灌胃量,连续8周。

1.5检测指标 分别于干预前(0周)及干预8周后8:00，以75%乙醇消毒实验大鼠尾尖部,采血针取血,检测FPG和2hPG,随后称体重并记录。干预8周后腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉大鼠,腹主动脉取血8 mL,室温静置2.5 h后3 000 r/min离心15 min存上清，按测试盒方法检测SOD、FFA、MDA水平，ELISA法检测大鼠C肽水平并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。HOMA-IR=1.5+FPG×空腹C肽/2 800[8]。

1.6统计学方法 采用Prism6软件做图，实验结果用SPSS 24.0软件分析,多组间比较用单因素方差分析,2组相比用独立样本t检验,方差齐用LSD法,方差不齐用T3法,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠干预前后体重和血糖比较 干预前，各组大鼠体重比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；模型组、二甲双胍组及施今墨对药配方各组FPG和2hPG均明显高于正常组(P均<0.05)，但各造模组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。干预8周后,模型组、二甲双胍组及施今墨对药配方各组大鼠体重均明显低于正常组(P均<0.05),FPG和2hPG仍明显高于正常组(P均<0.05);与模型组比较，二甲双胍组和施今墨对药配方低剂量组大鼠体重明显增高(P均<0.05),二甲双胍组和施今墨对药配方中、低剂量组大鼠FPG和2hPG均明显降低(P均<0.05),施今墨对药配方高剂量组仅2hPG明显降低(P<0.05)。见图1。

2.2各组大鼠血清FFA、SOD、MDA水平比较 模型组和施今墨对药配方各组血清FFA、MDA水平均明显高于正常组(P均<0.05),模型组血清SOD水平明显低于正常组(P<0.05)，二甲双胍组和施今墨对药配方各组血清SOD水平与正常组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。二甲双胍组和施今墨对药配方中、低剂量组血清FFA、MDA水平及施今墨对药配方高剂量组血清MDA水平均明显低于模型组(P均<0.05),二甲双胍组和施今墨对药配方各组血清SOD水平均明显高于模型组(P均<0.05)。见图2。

2.3各组大鼠血清C肽水平和HOMA-IR比较与正常组比较,模型组大鼠血清C肽水平降低而HOMA-IR升高(P均<0.05)；与模型组比较,二甲双胍组和施今墨对药配方各组血清C肽水平明显高于模型组(P均<0.05)，二甲双胍组和施今墨对药配方低剂量组HOMA-IR均明显低于模型组(P均<0.05)。见图3及图4。

3 讨 论

全球糖尿病地图(IDF Diabetes Atlas)第8版报告指出,2017年全球糖尿病患者约4.25亿,中国患者数位居第一，预测到2045年,糖尿病患者会达到6.29亿[9]。因此，糖尿病防治研究刻不容缓。2型糖尿病患者一方面以胰岛素抵抗为病理基础,胰岛素抵抗导致体内血糖、血脂利用减少,血糖增高、脂肪堆积、FFA水平增高,FFA的异常升高对机体有脂毒性,高FFA刺激ROS的产生,而过量的ROS又导致脂质过氧化产物MDA异常增加,清除氧自由基的SOD减少,使机体氧化与抗氧化处于失衡状态,启动氧化应激机制并激活炎症细胞产生更多的自由基,引发氧化应激进而损伤体内的β细胞;另一方面,氧化应激能干扰胰岛素信号转导并导致胰岛素抵抗,并且是引发2型糖尿病并发症的主要因素[10-11]。MDA 为机体内脂质过氧化反应的产物,其含量反映了机体细胞被自由基攻击的严重程度,是评价氧化损伤的关键指标[12]。SOD是机体内的主要氧自由基清除因子,其活性反映了机体抗氧化能力，可通过歧化反应将超氧化物催化为氧气和过氧化氢,阻断氧自由基对细胞的损害,同时可修复氧自由基损伤的细胞[13]。为此,本实验以FFA、SOD、MDA及HOMA-IR为主要指标,观察施今墨对药配方对上述指标的影响,初步探索该方的疗效机制。

施今墨对药配方是根据施今墨治疗2型糖尿病临床经验,以清肺胃热、补脾肾虚、化痰降浊为原则拟定的配方[3]。方中黄连配桑白皮清泻肺胃之热为主药,黄连配肉桂清火温肾，水火济济，引火归元；苍术配玄参为燥湿健脾化浊与滋阴降火配伍,燥润相济、升降相依；葛根配丹参为升阳生津与苦降活血相伍；佐以五味子、莱菔子和菟丝子敛肺补脾益肾、理气化痰,全方配伍切合该病病机。从中药治疗胰岛素抵抗的用药规律分析发现,治疗主药包括黄芪、黄连、白术、苍术等[14]。其中黄芪的主要成分黄芪多糖能增强SOD活性, 改善胰岛素抵抗[15]。黄连的主要成分黄连素可通过作用于FFA以改善胰岛素抵抗,起到降糖效果[16]。苍术-玄参配伍的多糖和正丁醇提取物能增强SOD活性,降低糖尿病小鼠血糖[17]。葛根素与丹参酮ⅡA联合用药能增强机体抗氧化能力,减少氧化应激损伤[18]；葛根素还可通过上调PI3K基因及蛋白表达促进GLUT4葡萄糖转运,改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的胰岛素抵抗状态[19]；临床研究亦发现葛根素能影响2型糖尿病患者的SOD、MDA水平,改善胰岛素抵抗[20]。上述研究提示,施今墨对药配方不仅切合中医病机，而且具有治疗2型糖尿病胰岛素抵抗并改善氧化应激的理论依据。

2型糖尿病动物模型是进行本实验的基础,根据2型糖尿病患者发病特征并参考动物模型制备文献[4-6],采用Wistar大鼠高糖高脂饲养+腹腔注射STZ的方法制备2型糖尿病大鼠模型,所制备的模型动物FPG、2hPG明显增高,具备了2型糖尿病的基本特征。给予相应药物干预8周，显示施今墨对药配方可降低FPG、2hPG、FFA、MDA水平，增加SOD活性,改善氧化应激损伤;可以升高C肽，降低HOMA-IR,有效改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗。由此说明,施今墨对药配方可有效降低血糖，改善脂代谢,其作用机制与调节FFA、SOD、MDA及胰岛素抵抗密切相关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。