常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒方法的研究和应用

郭艳飞

（瓦房店市疾病预防控制中心，辽宁 大连 116300）

腹泻是临床公认的常见病和多发病，也是引起死亡的主要因素。现阶段已证实，诺如病毒是引起婴幼儿腹泻的发病原因，主要以粪-口途径进行感染，通过人与人之间传播而引起更多人的感染，这不仅仅对食品卫生、人民健康造成较大威胁，也带来较大的经济损失[1]。诺如病毒是属于杯状病毒科，是导致非细菌性的急性胃肠炎重要病原体。据统计，世界范围内约一半的暴发型胃肠炎由诺如病毒引起，其中GⅠ、GⅡ型是世界范围内最常见的诺如病毒基因型，有全球流行的历史[2]。在我国，感染诺如病毒也主要为GⅠ、GⅡ型。近几年，由诺如病毒感染所致的胃肠炎疫情报道越来越多，成为重要的公共卫生难题。所以，快速、准确、特异的检测方法对疾病的预防和控制具有重大意义。现阶段还不能在体外进行诺如病毒培养，也缺少相关动物模型，其变异类型较多，检测比较困难，也不容易进行鉴别，传统的免疫学和血清学检测方法受到较大限制[3]。分子生物学技术的推广应用，给诺如病毒的检测带来较大福音。PCR技术是临床上检测基因的重要方式，也具有较大的优势[4]。因此，本研究旨在比较常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒的效果，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年7月至2020年7月我院210例腹泻患者粪便为研究对象，男性110例，女性100例，年龄3个月～13岁，平均年龄为（2.50±0.40）岁。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 收集入选者新鲜粪便，应用PBS制备成10%粪便混悬液，将其保持于-70 ℃低温环境中待测。

1.2.2 引物与探针 引物和探针序列见表1。

1.2.3 病毒RNA提取盒cDNA合成 采用TIANamp Virus RNA Kit来提取病毒RNA，严格根据试剂盒说明进行操作，然后应用PrimeScriptTMRT-Reagent Kit对提取的病毒RNA进行逆转录，操作过程同样严格按照试剂盒说明进行。

1.2.4 常规RT-PCR方法 应用正交设计优化最佳的PCR反应，选取最佳的退火温度。优化以后的PCR体系为25 μL，组分主要有：2.5 μL10×PCR Buffer，0.5 U Taq酶，上下游的引物各自为1.25 μL，3.0 μLdNTP，3.0 μL cDNA，应用灭菌注射用水将其补足至25 μL。94 ℃预变性3 min，94 ℃条件变性30 s，54 ℃条件退火30 s，72 ℃条件延伸30 s，总共进行40循环，72 ℃条件最终延伸10 min。应用分光光度计来定量阳性GⅠ、GⅡ型诺如病毒RNA，应用建立RT-PCR检测100～105copies/μL的病毒，分析病毒的最低检测下限，同时对札幌病毒、星状病毒、轮状病毒等进行检测，检验其特异性。

1.2.5 荧光定量RT-PCR方法 应用矩阵法来优选最优的荧光定量PCR体系。优化以后的PCR体系为20 μL，组分有：10 μL2×Premix Ex Taq，0.4 μL 50×R0x Reference Dye Ⅱ，上下游的引物各1.6 μL，其探针为0.8 μL，模板2.0 μL cDNA，应用灭菌注射用水将其补足至20 μL，反应的条件为：50 ℃条件2 min，95 ℃条件预变性30 s，95 ℃条件变性5 s，60 ℃条件退火34 s，总共进行40循环，在60 ℃条件下进行荧光信号收集。

表1 常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR引物和探针

1.2.6 病毒标准曲线制作 用来制作标准曲线的标准品，是含GⅠ、GⅡ型诺如病毒的扩增片段，紫光分光光度计来测定其浓度，并依据质粒的分子量换算为拷贝数。将质粒倍比8个梯度，为101～108copies/μL，每个梯度均应用荧光PCR进行检测，结束反应以后，通过收集的荧光信号值来绘制相应标准曲线。

1.2.7 临床样品检测 应用建立的两种PCR方法对采集的临床样品检测，并且比较其检测结果，检测出阳性结果进行测序来验证诺如病毒检测的准确性。

2 结果

2.1 两种检测方法特异性 这两种检测方法特异性均较强，与轮状病毒、札幌病毒、星状病毒之间无交叉反应，相同体系GⅠ、GⅡ型诺如病毒之间无干扰。

2.2 两种检测方法下限比较 常规RT-PCR的最低检测下限是103copies/μL，荧光定量RT-PCR的最低检测下限是102copies/μL。

2.3 两种检测方法检测率和符合率比较 常规RT-PCR的检测率为5.71%（12/210），符合率为66.67%（12/18），荧光定量RT-PCR的检测率为8.57%（18/210），符合率为100.00%（18/18）；对18例阳性样本进行测序分析，均证实为诺如病毒。

3 讨 论

病毒性腹泻是非细菌性常见的常见病，腹泻患者排泄物中含有大量致病病毒，容易引起腹泻的大流行，严重威胁公众的健康[5]。诺如病毒是引起病毒性腹泻的常见病原体，该病原体主要经口传播，也可以通过接触传播，具有较强的侵染力，其感染的剂量甚至可低至10～100个病毒粒子，传播比较迅速，较容易导致暴发[6]。因此其检测成为公共卫生检测的重点之一。现阶段，检测诺如病毒的主要方法为电镜法、免疫法以及分子生物法等，其中电镜法为最早检测方法，但是其灵敏度较低，样品的处理过程比较复杂，要求具有较高的技术，不利于推广应用[7]；免疫法多采用酶联免疫吸附，检测比较迅速，操作也相对简单，但是其假阳性率比较高，检出率也相对较低，也不是最佳的筛选方法；RT-PCR是分子生物学方法，该方法具有监测准确、迅速、灵敏度和特异性均较高的优势，被首推为检测的生物学方法。诺如病毒较容易出现变异，存在的类型也较多，GⅠ、GⅡ型是较常见的可以引起人类感染的类型，这两种类型也存在14和17种基因亚型，因此对检测提出较高要求，而引物设计也成为RT-PCR检测的关键技术。

常规RT-PCR检测方法每个反应只能扩增1个模板，并且需将扩增产物进行电泳分析，所以较容易产生PCR气溶胶污染，导致结果出现假阳性[8]。近年来，荧光定量RT-PCR技术逐渐发展，该方法利用荧光信号探针和实时定量检测相结合，是一种比较成熟的新技术，利用制备好的各个梯度阳性质量来控制样品的扩增Ct值，结合起始模板对数绘制曲线，对反应体系中起始模板进行定量[9]。该方法可以有效避免常规RT-PCR方法中电泳带来的污染。国内外研究发现，针对诺如病毒的引物和探针序列，以GI-SKF/GI-SKR、GII-SKF/GII-SKR为最佳引物，针对诺病毒的ORF1-ORF2连接处存在高度保守区基因设计引物（COGIF、COGIR、RINGI-TP、COG2F、COG2R、RINGII-TP），尤其对阳性的检测样品，该引物检测的高达99%的灵敏度，是现阶段灵敏度比较高的引物[7]。本研究通过观察常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR法检测诺如病毒，研究发现建立的两种方法检测诺如病毒均具有较高的特异性。常规RT-PCR的最低检测下限是103copies/μL，荧光定量RT-PCR的最低检测下限是102copies/μL。荧光定量RT-PCR的最低检测下限为常规RT-PCR的10倍，提示荧光定量RT-PCR检测效果更佳，即使较低的病毒载量，也能有效检测出来。通过比较两种检测方法检测率和符合率发现，常规RT-PCR的检测率为5.71%（12/210），符合率为66.67%（12/18），荧光定量RT-PCR的检测率为8.57%（18/210），符合率为100.00%（18/18），充分说明荧光定量RT-PCR具有较高的符合率，可以较好的筛查出诺如病毒，有效避免遗漏，通过对检出的阳性结果进行测序分析，结果发现均为诺如病毒。提示这两种检测方式均可以准确筛查出诺如病毒，未出现假阳性情况。但是，荧光定量RT-PCR具有更高的检测效率，敏感性更高，若进行诺如病毒检测，建议选取荧光定量RT-PCR。

综上所述，常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测诺如病毒均具有较好的特异性，荧光定量RT-PCR不仅能定性检测诺如病毒，还能进行定量分析，对病毒的致病剂量和风险进行评估，且检测的符合率也较高，为避免遗漏，建议选取荧光定量RT-PCR。