直肠癌中HuR表达水平及其对新辅助放化疗所致DNA损伤效应的影响

方昌义，杨明威，李韵松，杨 阳，何佳慧，余昌俊

结直肠癌是世界范围内频发的消化道恶性肿瘤，发病率及病死率长期居高不下。虽然近年来中国结直肠癌的多学科综合诊疗逐渐规范化、常态化，临床疗效提高，但总体生存率仍然不高，5年标准化生存率比欧美等发达国家低10%左右。尤其在为中低位直肠癌患者个体化制定最佳的治疗方案时不仅要兼顾手术根治性及功能的保护，还要取得最大肿瘤根治与最小生活质量影响的平衡，对于临床医师来说颇具挑战性。而且相对于结肠癌来说，中低位直肠癌的盆腔局部复发风险明显升高、预后较差。因此，对于中低位直肠癌，多数指南推荐实施放化疗和手术联合的序贯多学科综合治疗。然而，与单纯手术相比，虽然以术前新辅助放化疗为主的多学科综合治疗降低了中低位直肠癌患者的盆腔局部复发风险，但同时也带来了治疗副损伤。因此，筛选出可能从术前新辅助放化疗中获益的中低位直肠癌患者亚群进行精准施策，将是提高直肠癌尤其是中低位直肠癌患者临床疗效的良好策略，也是结直肠癌精准治疗及个体化治疗的重要环节。有文献报道，HuR参与调控细胞DNA损伤，与肿瘤的放化疗抵抗有关。该研究拟通过实验检测直肠癌组织中的HuR表达水平并验证其表达水平可影响直肠癌细胞对放化疗导致的DNA双链断裂的累积效应进而影响患者对新辅助放化疗的反应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

病例资料 共收集2018年9月—2019年10月间56例在安徽医科大学第一附属医院高新胃肠外一病区行根治性直肠癌切除术的中低位直肠癌组织标本，入选病例的直肠癌诊断为明确的病理组织学所证实并具有完整的术后病理报告资料；入选病例术前未行化疗、放疗、靶向及免疫治疗等抗癌治疗。标本取材及保存与近年研究相同。同时收集分析33例2019年1月—2020年2月期间入住安徽医科大学第一附属医院高新胃肠外一病区初次评估无法根治性切除且行术前新辅助放化疗的中低位直肠癌患者的肠镜活检石蜡包埋组织标本，所选标本均具有明确的病理组织学证据，其中伴有肝、肺转移者5例，前列腺、精囊腺、膀胱及附件侵犯者21例，髂血管旁淋巴结转移者7例。

1.1.2

试剂与仪器 兔抗人HuR单抗 (艾博抗贸易有限公司，上海)； GENMED细胞DNA损伤完全荧光检测试剂盒(GENMED scientifics公司，美国)；激光共聚焦显微镜(Leica公司，德国)。

1.2 方法

1.2.1

实时荧光定量PCR 加样及操作的具体步骤同前。设计HuR引物序列信息 (5′-3′)， 上游引物：5′-ATGAAGACCACATGGCCGAAGACT-3′(forward)；下游引物5′-AGTTCACAAAGCCATAGCCCA AGC-3′(reverse)；内参为GAPDH， 上游引物：5′-AGCCTCAAGATCAGCAATGCC-3′(forward)；下游引物：5′-TGTGGTCATGAGTCCTTCCACGAT-3′(reverse)。

1.2.2

免疫组化 免疫组化的步骤与评分标准与近年研究一致。

1.2.3

彗星实验 常规培养直肠癌细胞株DLD-1于直径约35 mm的细胞培养皿中24 h，然后将细胞暴露于5-Fu(5 μmol/L，单皿)中2 h，然后在室温下单次照射20 Gy，剂量率为0.81 Gy/min，照射后立即孵育细胞4 h后获取细胞，裂解并融于琼脂糖中，用70%乙醇固定，在黑暗中用SYBR绿色染色30 min。荧光显微镜拍摄彗星图像，并使用Casplab彗星分析软件测量每个样本至少50颗彗星的橄榄尾矩。

1.3 统计学处理

采用2方法半定量HuR的表达水平，student′

t

检验、χ检验分别用于比较中低位直肠癌组织标本对中的HuR表达水平差异及HuR的相对表达水平与术后临床病理特征之间的关系。绘制不同HuR表达水平直肠癌患者的Kaplan-Meier生存曲线并使用Log-rank检验比较两组患者术后总生存期差异。数据使用SPSS 22.0软件包进行统计学处理，

P

<0.05定义为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 直肠癌组织中HuR表达上调其相对表达水平与肿瘤恶性临床病理特征

Real-time PCR结果显示HuR在大部分中低位直肠癌组织中表达水平高于相应的癌旁正常组织 (36/56， 64.28%)。见图1。该研究根据临床病理特征分组进行比较，检验方法为卡方检验，结果显示HuR高表达组患者病理特征恶性程度高，临床分期较晚(Ⅲ期及Ⅳ期患者

n

=18，

P

=0.003)，微血管易受肿瘤累及(

n

=15，

P

=0.013)，淋巴结转移较多(

n

=12，

P

=0.019)，

P

<0.05，差异有统计学意义。见表1。随后分析了癌症基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA)公共数据库中一总数为159例直肠癌患者的样本的总生存数据，Kaplan-Meier 生存曲线显示HuR表达增高的直肠癌患者术后中位生存期为4.5年，术后5年总生存率低于50%，与HuR低表达患者组差异有统计学意义(

P

<0.01)。见图2。

表1 56例中低位直肠癌组织中HuR表达水平与不同临床病理指标之间的关系(n=56)

图1 HuR在直肠癌组织中表达的水平

图2 Kaplan-Meier 生存曲线与低表达患者组比较：log- rank P<0.001

2.2 中低位直肠癌组织中 HuR蛋白阳性表达水平与新辅助放化疗临床客观缓解率

免疫组化结果显示HuR在中低位直肠癌组织中阳性表达 (棕褐色颗粒阳性信号主要表达于细胞核)，而在配对的癌旁正常上皮组织中不表达或弱表达。见图3。随后该研究根据HuR蛋白阳性表达情况将33例中低位直肠癌患者分为两组，采用卡方检验分析HuR蛋白表达水平与患者对新辅助放化疗的临床反应的关系。分析结果表明HuR阳性表达的中低位直肠癌患者对新辅助放化疗反应较差，临床客观缓解率较低(

P

<0.05)。见表2；新辅助放化疗前后影像学资料对比结果显示HuR阳性表达患者新辅助放化疗前后病灶变化不大或无明显变化。见图4；部分行新辅助治疗后序贯手术的患者术后标本HE染色图片结果也显示HuR阳性表达患者肿瘤退缩较差。见图5。

图3 HuR在直肠癌组织及相应的癌旁正常上皮表达水平A、B：正常直肠黏膜上皮；C、D：直肠癌组织×100；E、F：直肠癌组织×400

图4 不同HuR水平的中低位直肠癌患者新辅助放化疗前后原发病灶影像学表现A、B：为新辅助治疗前的原发病灶增强CT图像；C、D：为新辅助治疗后同一层面的增强CT图像

图5 不同HuR水平的中低位直肠癌患者新辅助放化疗后的大体标本及HE染色图A、B：为福尔马林固定后的直肠大体标本；C、D：为对应的HE染色图片；箭头所示处显示新辅助治疗后肿瘤的退缩情况

表2 不同HuR表达水平对新辅助放化疗临床客观缓解的比较[n(%)]

2.3 HuR水平变化可影响直肠癌细胞受放化疗引起的DNA双链断裂 (DNA double-strand breaks，DSBs) 的累积

HuR导致放化疗抵抗可能与其影响肿瘤细胞DNA双链断裂的累积效应有关。该研究在直肠癌细胞株DLD-1中敲减HuR的表达，并通过彗星实验观察HuR表达抑制后DNA损伤效应是否发生改变，结果显示在细胞水平抑制HuR的表达后，与对照组比较，经过同等剂量化学药物及放射照射下抑制组细胞呈现彗星尾矩延长，差异有统计学意义(

P

<0.01)。见图6。提示DNA双链断裂的累积效应增加。由此表明HuR过表达影响DNA双链断裂的累积可能是导致肿瘤细胞放化疗抵抗的关键原因。

图6 彗星实验A、B：照射前的对照组及HuR抑制组细胞；C、D：照射后的对照组及HuR抑制组细胞；与Si-NC组比较：**P<0.01

3 讨论

近年来随着多学科协作(multi-disciplinary treatment,MDT)的加速建设和推广，结直肠癌的综合诊疗逐渐规范化、常态化，临床疗效得到大幅提升，但结直肠癌患者的总体预后仍不尽如人意，尤其是中低位直肠癌患者面临较高的盆腔局部复发风险。对于T3和(或)N+的中低位局部进展期直肠癌，新辅助放化疗序贯全直肠系膜切除术(total mesorectal excision,TME)已成为国内外多部指南推荐的标准治疗模式，这种模式的实施能够显著降低肿瘤分期、提高保肛机会和根治性手术切除率，并且可改善患者的5年总体生存率(overall survival，OS)及无病生存率(disease free survival，DFS)。但也有许多研究表明，新辅助放化疗后序贯手术患者的手术并发症如：吻合口瘘、吻合口狭窄、会阴部切口感染、术后切口延迟愈合等发生率明显高于单纯手术的患者；同时放化疗还会导致部分患者骨髓抑制、肝功能损害、机体免疫力下降、性功能受损、难治性盆腔炎、肛门节制功能下降、肠壁放射性水肿、肠管顺应性下降等不良后果。因此，在无法预估患者对新辅助放化疗的敏感性和不良反应之前，结直肠外科医师对于中低位直肠癌患者的治疗方案制定应持更加谨慎的态度。由此，筛选出适合术前新辅助放化疗的中低位直肠癌患者，将是提高临床客观缓解率和患者预后生存的良好策略，也是复杂直肠癌患者综合治疗个体化和精准化的内涵要求。

HuR (也称ELAVL1) 是胚胎致死性异常视觉(embryonic lethal abnormal vision， ELAVL)家族蛋白的成员之一，是一种RNA结合蛋白，优先与富含Au或U序列的3′-UTR区域结合，其主要位于细胞核，但受到特定刺激后可转移到细胞质中进而影响特定mRNAs亚群的稳定性和(或)翻译过程。与此相对应的是，HuR的高表达水平与包括散发型结直肠癌及家族性腺瘤息肉病(familial adenomatous polyposis， FAP)在内的多种恶性肿瘤的肿瘤分级和恶性程度密切相关，也与患者的治疗抵抗和预后不良紧密关联。其可能的机制是影响DNA双链断裂的修复，涉及抗凋亡作用以及Caspase-2分子的抑制等。由此，HuR具有评估包括新辅助放化疗在内的多种辅助治疗临床反应以及患者预后的潜能。

该研究表明，直肠癌组织中HuR表达增高，与之相一致的是免疫组化也显示直肠癌组织中HuR蛋白阳性表达率高于正常黏膜上皮组织。HuR的高表达水平与肿瘤pTNM分期及淋巴结阳性率、微血管浸润密切相关，该研究结果与Lang et al研究结果相一致。该研究TCGA公共数据库中159例直肠癌患者的生存数据来验证HuR表达水平也可影响患者的预后，结果表明HuR高表达直肠癌患者组5年OS仅有44% ，而HuR低表达患者组达到53%，差异有统计学意义。以上结果提示HuR高表达预示着肿瘤侵袭性强；HuR高表达是影响患者预后的因素之一。为了验证HuR表达水平对患者新辅助放化疗反应的影响，该研究首先运用免疫组化方法检测了33例行新辅助放化疗的中低位直肠癌患者的肠镜活检石蜡标本，并依据HuR蛋白阳性表达水平将患者分为两个亚组；随后通过卡方检验比较亚组患者对新辅助放化疗的临床反应，结果显示HuR阳性表达组患者的临床客观缓解率明显低于HuR阴性表达组患者两组间差异有统计学意义(χ/

P

值：11.448/0.001)。与此相一致的是，通过对比新辅助治疗前后的影像学资料，结果显示HuR阳性表达的患者新辅助放化疗前后肿瘤大小变化不明显，部分序贯手术患者的术后大体标本及HE染色也显示肿瘤退缩较差，临床疗效不佳。而在细胞水平，通过抑制HuR的表达，可增加电离辐射及化学药物5-FU所致DNA双链断裂的累积效应。以上结果进一步表明HuR参与中低位直肠癌患者的放化疗抵抗，影响患者预后。调控HuR水平可能是干预中低位直肠癌患者对新辅助治疗敏感性的有效途径之一。