miR-30a-5p/MTA1轴与喉鳞状细胞癌细胞Hep2生物学特性的相关性研究

裴 婷，张海利，陈 英，史 聪，樊慧娟

微小RNA(miRNA)是一类约20～24 nt所构成的内源性非编码单链小分子RNA，主要通过与互补靶系列结合干扰翻译发挥作用，改变蛋白的表达，影响细胞的生物功能。miR-30a-5p是其中的一员，据报道,调节miR-30a-5p可以影响多种恶性肿瘤细胞的进展，但是在喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)中未见报道。转移相关基因1(metastasis associated gene 1，MTA1)主要通过脱去相应抑癌基因组蛋白的乙酰基而重塑染色质的结构，使其结构紧密不易转录，减弱表达，增强癌细胞的转移。多数文献报道MTA1的过表达与人类恶性肿瘤的恶性程度及进展密切相关。前期研究表明过表达的MTA1可以促进LSCC细胞的增殖、迁移和侵袭，但是其发生机制尚未阐明。该研究通过生物信息技术以及相应的细胞功能实验观察细胞增殖、迁移、周期和凋亡的情况，表明 miR-30a-5p/ MTA1轴可能对LSCC的发生机制产生一定的作用，为今后的诊断、治疗和愈后提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

该实验所采用的LSCC细胞是Hep2细胞由耳鼻咽喉头颈外科山西省重点实验室提供。DMEM培养基、10%胎牛血清(FBS)、TRIzol试剂、opti-MEM购自美国赛默飞世尔科技公司;胰酶-EDTA溶液、PBS、细胞周期试剂盒和细胞凋亡试剂盒购自上海西格玛奥德利齐贸易有限责任公司;青链霉素购自上海英潍捷基贸易有限公司;谷氨酰胺购自北京沃卡威生物技术有限公司;CCK-8购自北京全式金生物技术有限公司;4%多聚甲醛购自武汉博士德生物工程有限公司;结晶紫购自北京索莱宝科技有限公司;Dual-Luciferase报告基因检测系统试剂购自美国普洛麦格公司;Lipofectamine3000 Invitrogen购自美国BD公司上海有限公司;SYBR Green PCR Master Mix购自上海东洋纺生物科技有限公司, miR-30a-5p模拟物和NC对照均购自上海吉玛制药技术有限公司;PCR引物购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养和转染 Hep2细胞培养在由DMEM培养基、10% FBS、双抗和谷氨酰胺配制的完全培养基中，置于37 ℃、 5% CO、95%湿度的孵箱中，培养至对数期时传代，进行细胞转染。取8×10个细胞铺于24孔板中，过夜后待细胞汇合度至70%～80%时，根据Lipofectamine3000说明书将miR-30a-5p mimics和miR-NC转染至细胞中，24 h后收集细胞，用于后续实验。

1

.

2.2

实时荧光定量PCR实验 在无酶的条件下实验，根据说明书提取RNA，并且利用光谱仪检测所提RNA的浓度，采用逆转录试剂盒扩增cDNA，以U6作为内参，15 μl的体系，根据实时荧光定量PCR说明书进行定量检测。所采用的引物见表1。该实验采用StepOne Plus(出自ABI)检测表达量。

1.2.3

双荧光素酶报告实验 首先，设计MTA1 3′UTR的野生型和突变型引物。见表1。其次，进行载体构建，包括多聚酶链反应、琼脂糖凝胶电泳、胶回收、酶切、连接、转化、质粒提取多个步骤，构建出miR-30a-5p 模拟物+ pGL4.10+pGL 4.73双荧光素酶报告载体共转染至对照组和实验组。转染48 h后根据Promega 提供的说明书进行双荧光素酶报告基因实验。

表1 引物序列

1.2.4

CCK-8实验 将转染后的Hep2细胞以3 000个/孔铺至96孔板中，设置3个复孔，20 h后更换完全培养基，23 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液并放入37 ℃、5% CO、95%湿度的孵箱中培养1 h后，用酶标仪分别测其24、48、72 h后450 nm的吸光度值(避光操作)。

1.2.5

Transwell细胞迁移实验 根据说明书将转染后的细胞用200 μl无血清培养基重悬后加入培养板小室的上室，在下室加入500 μl的DMEM完全培养基，孵箱中孵育24 h后，用干净棉签抹去上室的细胞，用300 μl、4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤1次，300 μl、1%结晶紫染色10 min，PBS洗涤1次，在显微镜下观察并拍照统计。

1.2.6

流式细胞术检测细胞周期和凋亡实验 将用miR-30a-5p模拟物实验组和NC对照组转染后的细胞收集1×10个细胞，根据流式细胞术检测细胞周期和凋亡实验的说明书进行相关操作步骤，并记录分析实验结果。

2 结果

2.1 双荧光素酶报告实验和实时荧光定量PCR实验检测结果

采用软件miR Base和Target Scan Human 7.2检测出MTA1是miR-30a-5p的一个靶基因，进行了双荧光素酶报告实验和实时荧光定量PCR实验。双荧光素酶报告显示，miR-30a-5p mimics+ pGL4.10+pGL 4.73分别与其野生型和突变型比较表达水平为(0.41±0.06)和(0.91±0.01)，差异有统计学意义(

t

=19.57，

P

<0.05)，miR-30a-5p可以抑制野生型(WT) MTA1 3′UTR报告基因载体的荧光素酶活性，而对突变型(MUT) MTA1 3′UTR影响甚小。实时荧光定量PCR实验结果显示，miR-30a-5p mimics实验组和miR-NC对照组表达水平分别为(12.62±0.97)和(1.04±0.32)，实验组转染后是高表达的，差异有统计学意义(

t

=15.71，

P

<0.05)。见图1。

图1 双荧光素酶报告实验和实时荧光定量PCR实验检测结果A：miR-30a-5p与MTA1的结合位点及突变位点；B：荧光素酶的相对活性；C：转染后实验组和对照组中表达水平；与miR-NC组比较：***P<0.001

2.2 CCK-8实验结果

CCK-8实验结果显示，miR-30a-5p mimics实验组与miR-NC对照组的24、48、72 h增值率分别为(33.88±1.81)%，(53.34±2.64)%，(93.50±11.27)%；(47.40±2.32)%，(93.76±5.50)%，(162.91±6.62)%，统计分析后得出

t

=13.20、

t

=24.45、

t

=11.74、

P

<0.05，差异有统计学意义。根据所测得的吸光度值的平均数计算出相对倍数绘制折线图，miR-30a-5p mimics实验组比miR-NC对照组24、48、72 h的吸光度值相对倍数低。见图2。

图2 CCK-8实验检测miR-30a-5p过表达后细胞增殖相对倍数

2.3 Transwell迁移实验结果

在Transwell迁移实验结果显示，miR-30a-5p mimics实验组和miR-NC对照组细胞数目分别为(207.67±7.23)个和(369.00±41.22)个(

t

=11.34，

P

<0.05)，过表达miR-30a-5p后的Hep2细胞迁移数目降低，差异有统计学意义。见图3。

图3 Transwell实验检测miR-30a-5p过表达后细胞迁移数 ×100与miR-NC对照组比较：*P<0.05

2.4 喉鳞状细胞癌过表达miR-30a-5p的Hep2细胞周期情况

该实验通过流式细胞术分别检测转染后细胞周期和凋亡情况。经3次独立重复实验分析结果表明miR-30a-5p mimics实验组G1期、S期和G2期均较miR-NC对照组小，对照组G0/G1=63.08、G2/M=13.43，实验组G0/G1=59.86、G2/M=9.41，说明发生了细胞周期阻滞，即过表达miR-30a-5p的Hep2细胞增殖降低，进一步说明过表达miR-30a-5p的Hep2细胞抑制喉鳞状细胞癌细胞Hep2的增殖。细胞凋亡实验结果显示过表达miR-30a-5p的Hep2细胞凋亡较miR-NC多，同时经过计算分析得出miR-NC对照组凋亡率为(4.52±2.12)%，miR-30a-5p mimics实验组凋亡率为(22.61±5.70)%，可见过表达miR-30a-5p的Hep2细胞凋亡率更高，差异有统计学意义(

t

=5.51，

P

<0.05)。见图4。

图4 流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况A：过表达的miR-30a-5p较miR-NC细胞周期受到阻滞；B：过表达的miR-30a-5p较miR-NC细胞凋亡增多

3 讨论

该研究前期实验已表明过表达的MTA1可以促进LSCC细胞的增殖、迁移和侵袭。为更加深入探讨其促癌机制，该实验做了进一步研究，实验结果表明MTA1可能是miR-30a-5p的一个潜在的直接靶基因，过表达的miR-30a-5p可以抑制LSCC细胞Hep2细胞系增殖、迁移和细胞周期，促进细胞系凋亡，从而影响LSCC的进展，进一步表明miR-30a-5p/ MTA1轴可能对LSCC的发生机制发挥一定作用。

近年来，已有多数文献报道miR-30a-5p通过靶向作用参与多种恶性肿瘤细胞的进展，其中包括胆囊癌、肝细胞癌、乳腺癌等，但其与LSCC之间的关系尚未见报道。据相关文献报道miRNA家族中有一些与LSCC的进展相关。Xu et al报道在喉癌患者中miR-149呈低表达，影响生存率，与患者的预后密切相关，通过体外实验表明高表达的miR-149可以抑制癌细胞增长，诱导细胞凋亡。Zhang et al报道高表达miR-23a能提高喉癌细胞淋巴转移的程度，恶化临床分期，降低5年生存率。Re et al报道在LSCC中miRNA家族中可能并不只是单一的成员起到主要作用，可能是相互之间的影响而起到更明显的作用，研究表明miR-21-5p、miR-let-7a、miR-34c-5p可能与癌细胞的进展有关，其中miR-21-5p/ miR-let-7a的值可能对区分正常组织和肿瘤组织有重要的临床诊断意义，miR-let-7a可能有助于预测癌细胞淋巴结转移。由此可以看出，miRNA家族成员与喉癌的恶性进展密切相关，且并不只是相对应的一种miRNA起作用，可能会涉及到多种miRNA一起作用，或为协同，或为拮抗，这为将来的机制研究提供更多新的思路。

在多种恶性肿瘤中，MTA1参与了肿瘤细胞的进展，如LSCC、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝细胞癌等。在该研究中，为了进一步探讨MTA1在LSCC中的促癌机制，通过生物信息软件TargetScan和miRBase检测出MTA1在213～219位处与miR-30a-5p的碱基序列相互配对，使得它们之间在理论上建立密切的相互关系，通过多数体外细胞实验结果表明MTA1可能是miR-30a-5p的一个潜在靶基因，过表达的miR-30a-5p能抑制LSCC细胞Hep2的增殖、迁移和细胞周期，促进细胞凋亡，这为今后LSCC的诊断、治疗和愈后提供新的探索方向。虽然实验有相应的结果，但该研究仍有一定的局限性，潜在的机制仍需要进一步的探讨。