杀扑磷降解产物的鉴定及在蔬菜中残留量的检测

2021-04-08朱正伟吴婉琴范小龙王会霞

食品与机械 2021年3期

朱正伟陈锂吴婉琴江丰范小龙王会霞

(1. 湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北武汉 430070；2. 湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，湖北武汉 430070)

中国是蔬菜生产大国，同时也是蔬菜消费大国。据农业农村部网站数据库[1]显示，2018年中国蔬菜产量已超过7.03亿t。蔬菜在种植过程中会不同程度地使用杀虫剂、除草剂、杀菌剂等农药，2018年中国农药使用量为150.36万t[2]。

杀扑磷是一种硫代磷酸酯类有机磷农药，对介壳虫的防治具有特效[8]，被广泛应用于果树、棉花、蔬菜等作物的失尖蚧、糠片蚧、蜡蚧、粉蚧等害虫、害螨的防治[8]。杀扑磷属于高毒性农药，对人类、鸟类、鱼类等[9-10]多种生物均具有毒害作用。目前关于杀扑磷的研究主要集中于其检测[11-12]和毒性[13-14]分析，对其降解物的研究暂未见报道。文章拟分析鉴定杀扑磷的降解产物，建立蔬菜中杀扑磷及其降解物残留量的检测方法，为杀扑磷及其降解物的食品安全风险监测提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

乙腈、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠、无水硫酸镁：分析纯，上海国药化学试剂有限公司；

韭菜、包菜、西红柿、芹菜：市售；

杀扑磷农药：市售；

杀扑磷标准品：纯度≥99.9%，美国Supelco公司；

牛津郡杀扑磷标准品：纯度≥98.5%，日本WAKO公司；

乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶(PSA)：40～60 μm，北京艾杰尔科技有限公司；

石墨化炭黑(GCB)：40～120 μm，北京艾杰尔科技有限公司；

陶瓷均质子：2 cm(长)×1 cm(外径)，上海安谱实验科技股份有限公司；

有机相微孔滤膜：0.22 μm，天津市津腾实验设备有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱—串联质谱仪：TSQ型，美国沃特斯公司；

高效液相色谱—四极杆—飞行时间高分辨液质联用仪：Triple TOF 5600+型，美国AB Sciex公司；

分析天平：MSA125P-1CE-DU型，德国Sartorius公司；

分析天平：ME204/02型，梅特勒—托利多仪器有限公司；

离心机：Allegra X-15R型，美国Beckman公司；

均质器：T25 digital型，德国IKA公司；

涡旋混合器：945605型，美国TALBOYS公司；

超纯水仪：Milli-Q型，美国Millipore公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 标准储备溶液准确称取10 mg(精确至0.1 mg)各农药标准品，用色谱纯乙腈溶解并定容，配成浓度为1 000 mg/L 的标准储备溶液，-18 ℃避光保存。

1.3.2 标准中间溶液准确吸取一定量的农药标准储备溶液于容量瓶中，用乙腈定容配制成浓度为200 mg/L的标准中间液。

1.3.3 混合标准系列工作液分别吸取一定量的农药标准中间溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成混合标准使用溶液，其中杀扑磷质量浓度分别为1，5，10，20，40，60，100 ng/mL，牛津郡杀扑磷质量浓度分别为1，3，6，15，30，60，100 ng/mL。

1.3.4 基质混合标准工作溶液取1 mL空白基质溶液氮气吹干，加入1 mL相应质量浓度的混合标准系列工作液复溶，过微孔滤膜。基质混合标准工作溶液应现用现配。

1.4 试验方法

1.4.1 自然光下水中杀扑磷降解产物研究准确移取50 μL 杀扑磷中间液于玻璃比色管中，用超纯水定容至20 mL，摇匀后置于自然光下，每天移取0.60 mL直接进行UPLC-Q-TOF-MS分析，数据用Peakview软件分析，降解产物的毒性通过美国环境保护署的毒性估算软件工具Toxicity Estimation Software Tool(T.E.S.T.)进行计算。

1.4.2 杀扑磷农药成分分析按GB 20682—2006执行。

1.4.3 蔬菜中杀扑磷及其降解产物残留量检测方法的建立

(1) 试样制备：韭菜、西红柿、甘蓝、芹菜取可食用部分，切碎后放入组织捣碎机中打成匀浆，于聚乙烯瓶中冷冻贮藏。

(2) 基质含量对杀扑磷及其降解物残留量的影响：称取10 g(精确至0.01 g)蔬菜样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，1颗陶瓷均质子，涡旋提取1 min，加入7 g 氯化钠，4 000 r/min离心5 min，取上清液分别用乙腈稀释0，2，5，10，20，50倍，以此稀释液为溶剂，配制质量浓度为0.1 μg/mL的杀扑磷和牛津郡杀扑磷溶液，进行UPLC-MS/MS分析。

(3) 石墨化炭黑(GCB)对杀扑磷和牛津郡杀扑磷的吸附：准确移取100 μL标准中间液于50 mL容量瓶，用乙腈定容后摇匀，移取2 mL于15 mL离心管中，并分别加入0，10，20，30，40，50，60，80，100，150 mg GCB，涡旋30 s，4 000 r/min离心3 min，取上清液进行UPLC-MS/MS分析。

(4) 3种QuEChERS方法比较：EN-QuEChERS农残方法参照EN 15662、AOAC-QuEChERS农残方法参照AOAC Official Method 2007.01，原始QuEChERS方法的前处理为：称取10 g样品于50 mL离心管，加入10 mL乙腈、4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠，剧烈振荡1 min，4 000 r/min 离心3 min，从乙腈层移取6 mL置于15 mL离心管中，加入900 mg无水硫酸镁和150 mg PSA涡旋1 min，4 000 r/min离心3 min，取上清液过0.22 μm有机滤膜后进行UPLC-MS/MS分析。

(5) 线性范围测定：按1.3.3的方法分别配制4种基质(韭菜、西红柿、甘蓝、包菜)标准工作液，进行UPLC-MS/MS分析。

(6) 定量限测定：在韭菜、西红柿、甘蓝、包菜中添加适量的标准溶液，按已优化好的方法进行处理，上UPLC-MS/MS分析，计算杀扑磷和牛津郡杀扑磷的信噪比(S/N)，以S/N为10时的加标水平为定量限。

(7) 基质效应：根据杀扑磷和牛津郡杀扑磷在韭菜、西红柿、甘蓝、芹菜基质标准曲线中的斜率，按式(1)计算基质效应。

ME=(km/ks-1)×100%，

(1)

式中：

ME——基质效应，%；

km、ks——基质标准曲线和溶剂标准曲线的斜率。

当-20%

(8) 准确度测定：依据中华人民共和国农业部公告2386号《农药残留检测方法国家标准编制指南》，选取杀扑磷质量浓度分别为0.005，0.015，0.050 mg/kg，牛津郡杀扑磷质量浓度分别为0.003，0.010，0.050 mg/kg的加标水平，按已优化的前处理方法进行加标回收试验，每个加标水平重复6次。

(9) 精密度测定：根据杀扑磷和牛津郡杀扑磷准确度试验中的6次重复性结果，计算不同加标水平的RSD。

1.4.4 仪器条件

(1) UPLC-Q-TOF-MS条件:液相色谱条件：C18色谱柱，50 mm×2.1 mm×1.7 μm，流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样量5 μL，流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸—水溶液，其梯度洗脱程序见表1。

质谱条件：离子源为电喷雾电离源(ESI)，正离子扫描，采集范围m/z50～1 000，离子源温度550 ℃。

(2) UPLC-MS/MS条件:液相色谱条件：C18色谱柱，50 mm×2.1 mm×1.7 μm，流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样量5 μL，流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸—水溶液，其梯度洗脱程序见表2。

质谱条件：离子源为电喷雾电离源(ESI)，正离子扫描，多反应监测，离子源温度120 ℃，脱溶剂温度450 ℃，毛细管电压2 500 V，其定性离子对、定量离子对及锥孔电压和碰撞能量见表3。

2 结果与分析

2.1 自然光下水中杀扑磷降解产物的鉴定

表1 梯度洗脱程序

表2 梯度洗脱程序

表3 杀扑磷和牛津郡杀扑磷的质谱参数

利用T.E.S.T.软件计算杀扑磷和牛津郡杀扑磷的毒性，其结果见表4。由表4可知，大鼠经口LD50、生物富集因子的计算值与试验值比较接近，说明利用T.E.S.T.软件计算的结果具有一定的参考性。牛郡津杀扑磷的LD50高于杀扑磷，但按中国农药的毒性分类，其仍属于高毒农药，具有遗传毒性。

2.2 杀扑磷农药成分分析

经上机分析发现，购买的杀扑磷农药中，杀扑磷和牛津郡杀扑磷含量分别为71.0，1.5 g/kg，说明杀扑磷农药在生产阶段或贮藏过程中易降解为牛津郡杀扑磷，将其喷洒于植物后，会在植物中残留。

2.3 蔬菜中杀扑磷及其降解产物残留量检测方法的建立

2.3.1 基质含量对杀扑磷及其降解产物残留量的影响

由图2、图3可知，不论是颜色深的韭菜还是颜色浅的甘蓝，随着稀释倍数的增加，基质含量降低，杀扑磷和牛郡津杀扑磷的响应与同浓度的溶剂标准溶液的响应越接近，说明基质含量对杀扑磷和牛津郡杀扑磷的响应影响较大，有必要对样品进行净化处理，减小基质带来的抑制影响。

图1 杀扑磷及其降解产物的提取色谱图Figure 1 Extract chromatogram of methidathion and methidathion-oxon

表4 T.E.S.T.软件计算的杀扑磷和牛郡津杀扑磷的毒性数据

2.3.2 GCB对杀扑磷和牛津郡杀扑磷的吸附影响 GCB可以很好地除去蔬菜中的色素，减弱基质效应，减轻对仪器的污染，但除去色素的同时，也会对一些平面结构的农药具有强的吸附性。由图4、图5可知，随着GCB加入量的增多，杀扑磷和牛郡津杀扑磷的回收率均下降，但杀扑磷对GCB表现得更敏感；当GCB加入量相同时，牛郡津杀扑磷的回收率明显高于杀扑磷，故选择两者回收率均>80%时为GCB的较优加入量，即加入量为25 mg/mL。

2.3.3 3种QuEChERS前处理方法比较由图6、图7可知，3种前处理方法对牛津郡杀扑磷回收率无显著差异；EN-QuEChERS前处理方法对杀扑磷的回收率优于其他两种方法，故选择改良后的EN-QuEChERS方法为较优方法。

2.3.4 线性范围上机测定发现，当样品质量浓度为1～100 ng/mL 时，韭菜、西红柿、甘蓝、芹菜的基质匹配标准曲线线性良好(R2≥0.99)。

2.3.5 定量限试验发现，杀扑磷和牛津郡杀扑磷的最优定量限分别为0.005，0.003 mg/kg，其在4种基质中的信噪比见表5。

2.3.6 基质效应由图8可知，杀扑磷在西红柿基质中呈中等强度的基质效应(20%<|ME|<50%)，在其他基质中呈强的基质效应(|ME|≥50%)；牛津郡杀扑磷在西红柿中呈弱的基质效应(|ME|≤20%)，在包菜和芹菜中呈中等强度的基质效应(20%<|ME|<50%)，而在颜色最深的韭菜中呈强的基质效应(|ME|≥50%)。净化后，净化液基本呈无色，但基质效应仍很强，所以在杀扑磷及其降解产物牛津郡杀扑磷的检测过程中仍需用基质匹配标准曲线进行定量。

Ks表示溶剂标准溶液，K0、K2、K5、K10、K20、K50分别表示稀释0，2，5，10，20，50倍的基质标准溶液图2 基质含量对杀扑磷响应的影响Figure 2 Effect of different matrix concentrations on the response of methidathion

Ks表示溶剂标准溶液，K0、K2、K5、K10、K20、K50分别表示稀释0，2，5，10，20，50倍的基质标准溶液图3 基质含量对牛津郡杀扑磷响应的影响Figure 3 Effect of different matrix concentrations on the response of methidathion-oxon

图4 GCB加入量对杀扑磷回收率的影响Figure 4 Effect of different GCB content on the recovery of methidathion

图5 GCB加入量对牛津郡杀扑磷回收率的影响Figure 5 Effect of different GCB content on the recovery of methidathion-oxon

图6 3种QuEChERS前处理方法对杀扑磷回收率的影响Figure 6 Effect of three QuEChERS pretreatmentmethods on recovery of methidathion

图7 3种QuEChERS前处理方法对牛津郡杀扑磷回收率的影响Figure 7 Effect of three QuEChERS pretreatment methods on recovery of methidathion-oxon

表5 杀扑磷和牛津郡杀扑磷在4种基质中的信噪比

2.3.7 准确度由图9、图10可知，低、中、高加标水平下，杀扑磷和牛津郡杀扑磷在4种基质中的回收率分别为68.5%～97.2%，62.9%～94.3%，均能满足《农药残留检测方法国家标准编制指南》的要求。

2.3.8 精密度由表6可知，杀扑磷和牛郡津杀扑磷的RSD均在《农药残留检测方法国家标准编制指南》规定的范围之内。

3 结论

通过优化前处理方法，建立了蔬菜中杀扑磷及其降解产物残留量的检测方法，该方法的线性范围、定量限、基质效应、准确性和精密度等指标均能满足《农药残留检测方法国家标准编制指南》的要求，适用于植物源中杀扑磷及牛津郡杀扑磷残留量的测定。自然条件下，杀扑磷易降解为牛津郡杀扑磷，但牛津郡杀扑磷的稳定性如何，会继续降解成何种物质，有待进一步研究。