挤压膨化对青稞中不同形态多酚组成及抗氧化活性的影响

何扬航 刘 刚,2 夏 陈 邓俊琳 林长彬 向卓亚 陈 建 张文会

(1. 四川师范大学生命科学学院，四川 成都 610101；2. 四川师范大学食品功能及加工应用研究所，四川 成都 610101；3. 四川省农业科学院农产品加工研究所，四川 成都 610066；4. 西藏自治区农牧科学院农产品开发与食品科学研究所，西藏 拉萨 850000)

青稞(HordeumvulgareLinnvar. nudum Hook. f.)又称元麦或裸大麦，年产量占西藏自治区粮食总产量的65%以上，种植面积约为1.18×106hm2[1-2]。青稞常用于制作成糌粑、面、馒头、饼干等食品[3]。因富含多酚[4-5]、维生素[6]等物质，青稞对糖尿病[7-8]、心血管疾病[9]、肠道癌[10]等有预防和缓解作用。多酚是青稞中含量丰富的次级代谢产物[11]，能通过调节氧化酶活性的方式起到抗氧化的效果，与青稞的功能活性有着紧密联系[12]。

挤压膨化是青稞比较成熟的加工方式之一，也广泛应用于薯类和其他谷物类的原料加工中。经过加工后，原料中的淀粉、蛋白质、纤维素等物质在高温、高压及高剪切力的作用下结构会发生变化，其制品的口感、营养价值随之改变[13]。目前相关研究主要集中于挤压膨化加工对青稞产品的质构、消化性和氨基酸等方面[14-15]，关于挤压膨化对青稞多酚组分的影响还未见报道。试验拟采用工业化的挤压膨化技术设备与条件处理青稞，比较膨化前后青稞中不同形态多酚构成及抗氧化活性的变化，以期为挤压膨化技术更广泛地应用到青稞的加工之中以及青稞食品的营养价值评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

青稞：独立花，产自四川阿坝自治州若尔盖县；

碳酸钠、福林酚、无水乙醇、甲醇、氯化钾、硝酸铝、氢氧化钠、盐酸、亚硝酸钠：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；

没食子酸、水溶性维生素E：北京索莱宝科技有限公司；

高效液相色谱仪：1260型HPLC仪，美国Agilent公司；

高速离心机：H2050R-1型，湖南湘仪离心机仪器有限公司；

旋转蒸发仪：Hei-VAP Advantage ML型，德国Heidolph公司；

紫外分光光度计：UV-1750型，日本岛津公司；

超声波清洗仪：KQ-250DB型，昆山超声仪器厂；

旋转双螺杆挤出机：DS30型，山东赛信膨化机械有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 青稞挤压膨化处理 将青稞粉碎过80目筛，称取100 kg，加入至螺旋双杆挤出机中，通过喷淋和搅拌的方式进行水分调节，使原料含水率达到22%左右。设置挤压机前、中、后段温度分别为50，125，135 ℃，螺杆旋转速率为28 Hz，进料速度为3 kg/min，制得挤压膨化青稞，含水量为8%。置于烘箱40 ℃干燥4 h后，装入自封袋，待测试用。

1.2.2 青稞多酚的提取与测定

(1) 青稞游离型多酚的提取：参照时东方等[16]的方法，略作修改。精确称取青稞粉1.00 g，加入体积分数为80%的甲醇溶液8 mL室温下超声40 min，离心(6 000 r/min，10 min)收集上清液。残渣用同样方法提取2次，合并3次上清液，45 ℃下真空浓缩蒸出丙酮，用6 mol/L 盐酸调pH至2.0左右，先用等体积正己烷萃取2次，弃掉正己烷层，再用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，45 ℃下真空浓缩至干，用80%体积分数的甲醇溶液定容至5 mL，通过0.22 μm有机膜过滤，得青稞游离态多酚。

(2) 青稞酯化型多酚的提取：在上述萃取后的水相中，加入等体积的4 mol/L的氢氧化钠，室温避光密封碱解4 h，用6 mol/L盐酸调pH至2.0左右，再用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，45 ℃下真空浓缩至干，用体积分数为80%的甲醇溶液定容至5 mL，通过0.22 μm 有机膜过滤，得酯化型多酚。

(3) 青稞结合型多酚的提取：在上述提取过游离酚的残渣中加入20 mL正己烷，离心(3 000 r/min，10 min)，弃去上清液，再加入2 mol/L NaOH溶液20 mL，密封后室温下震荡2 h。所得水解液用6 mol/L盐酸调pH至2.0左右，用等体积乙酸乙酯萃取3次，离心(3 000 r/min，5 min)，合并乙酸乙酯萃取相，45 ℃下真空浓缩至干。用体积分数为80%的甲醇溶液定容至5 mL，0.22 μm有机膜过滤，得结合型多酚。

3种形态青稞多酚提取物-20 ℃避光保存，所有提取操作重复3次。

(4) 总多酚的测定：参照夏陈等[17]的方法，略作修改。将多酚提取液进行稀释，使样品没食子酸含量在标准曲线0.0～600.0 μg可测范围内。每种提取液加入20 μL 福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂，混合均匀、放置10 min，加入碳酸钠终止反应。室温下避光静置80 min后，于765 nm处测定吸光度。配制不同质量浓度梯度的没食子酸标准品制作标准曲线，线性回归方程为：y=0.002 9x±0.026 3，R2=0.998 2。多酚含量以每100 g 样品等同于没食子酸的毫克数表示，总多酚含量为分别测定的结合型、酯化型和结合型多酚含量之和。

1.2.3 多酚单体组成分析 采用HPLC法。色谱条件：Poroshell 120 PFP column柱(4.6×100 mm，2.7 μm)；流动相为0.005%的甲醇(A)和乙腈(B)；梯度洗脱程序：0～10 min，5%～10% B；10～20 min，10%～20% B；20～35 min，20%～40% B；35～40 min，40%～70% B；40～45 min，70%～95% B。流速0.8 mL/min；柱温30 ℃；二极管阵列检测器；检测波长245，280，320 nm。

通过与7种多酚化合物标准品(表1)的保留时间对比，确定色谱峰所代表的化合物种类，通过峰面积计算出检测的多酚化合物含量。

表1 回归方程及线性范围

1.2.4 抗氧化活性测定 参照刘刚等[18]的方法，略作修改。准确吸取50 μL 3种类型多酚提取液于试管中，加体积分数80%的甲醇溶液80 μL，混合均匀后加入0.2 mmol/L DPPH溶液100 μL，充分摇匀，25 ℃下避光反应30 min，于517 nm处测定吸光值。每组试验3个平行。配制不同浓度梯度的水溶性维生素E标准品制作标准曲线，线性回归方程为：y=0.942 8x-0.420 2，R2=0.997。抗氧化能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)用水溶性维生素E当量表示。计算公式：

(1)

式中：

K——DPPH自由基清除率，%；

A1——样品吸光度值；

A2——对照吸光度值；

A0——空白吸光度值。

1.3 数据分析

使用t检验比较两种工艺样品多酚组间差异性，P<0.05表示有显著性差异。用Pearson相关分析比较多酚组分含量与总ORAC的相关性，P<0.05表示有显著相关性。

相关性分析采用SPSS 20.0统计学软件进行，图样使用Sigmaplot 14.0软件绘制。

2 结果与分析

2.1 不同形态多酚含量

挤压膨化前后青稞中不同形态多酚含量见表2。未膨化青稞的总多酚含量为(164.29±8.09) mg/100 g，与董吉林等[19]对青稞营养分析的结果相近。经挤压膨化处理后，总多酚降低了52.7%(P<0.01)，游离型和结合型多酚分别降低了89.3%(P<0.01)，23.7%。相关研究[20]表明，双螺杆挤出机是一个温度和剪切力不均匀的反应器，挤压膨化过程可能会导致物质化学键断裂、分子量变化，推测青稞主要的多酚可能在反应时被破坏，含量降低；而酯化型多酚本身含量较低，处理后略微增加(P<0.05)，可能是在较高温度、压力下，与纤维素等连接的糖苷型多酚断裂释放出来，被检测出的酯化型多酚含量增加[15]。同时，在有关糙米的类似试验[21]中，也发现结合型多酚含量高于游离型多酚和酯化型多酚，结合型多酚可能是青稞多酚最稳定的形式。

2.2 多酚单体

对青稞中3类多酚的7种单体分别进行HPLC分析，结果见图1。

由图1可知，在该色谱条件下7种酚类化合物标准品均能清晰分离。样品条带上7个目标峰的保留时间与多酚标准品条带上的7个色谱峰时间一致，表明在该色谱条件下青稞样品中的7种酚类化合物能够得到很好的分离。

由表3可知，经挤压膨化处理后，游离型多酚提取物中对羟基苯甲酸、阿魏酸含量分别增加了0.05，2.02 μg/g，检测出的多酚总含量增加了6.94 μg/g (P<0.01)，种类由3种增加到6种，可能是因为在高温、高剪切力条件下，结合型的香草醛、对香豆酸和芥子酸从青稞中释放出来。酯化型多酚提取物中仅检测出阿魏酸(1.66 μg/g)。结合型多酚提取物中7种酚类化合物均有测出，其中对羟基苯甲酸、香草酸、香草醛、肉桂酸含量均显著降低(P<0.01)，分别降低了0.16，0.69，1.05，2.02 μg/g，对香豆酸、阿魏酸、芥子酸含量分别增加了2.26，33.74，0.44 μg/g；推测可能是经挤压膨化处理后其结构更为蓬松，NaOH更易作用于与纤维素、多糖等，使阿魏酸更易溶出。在各种形态的多酚提取物中，均为阿魏酸含量最高，Zhu等[4]的研究结果与此相近，阿魏酸是青稞中最丰富的多酚化合物，主要是以不溶性结合态存在于青稞中。

表2 青稞中不同形态的多酚含量†

1. 对羟基苯甲酸 2. 香草酸 3. 香草醛 4. 对香豆酸 5. 阿魏酸 6. 芥子酸 7. 肉桂酸 检测样品从下至上依次为：标准品、膨化游离酚、未膨化游离酚、膨化酯型酚、未膨化酯型酚、未膨化结合酚、膨化结合酚图1 青稞中3种形态多酚的HPLC检测Figure 1 HPLC detection of three forms of polyphenols in hulless barley

2.3 抗氧化活性

青稞中游离型、酯化型及结合型多酚的抗氧化能力(ORAC)见图2。挤压膨化处理后青稞游离型和结合型多酚提取物抗氧化能力分别降低了89.9%(P<0.01)，29.5%(P<0.05)，酯化型多酚提取物抗氧化能力增加了78.5%(P<0.01)。结合2.1各种形态多酚含量的检测结果发现，3种形态多酚抗氧化能力与其多酚含量呈一定程度的正相关。

表3 青稞中7种多酚单体的检测†

#. 有显著性差异(P<0.05)，##. 有极显著差异(P<0.01)。图2 青稞多酚化合物抗氧化能力指数Figure 2 ORAC value of polyphenolic conpounds in hulless barley (n=3)

2.4 相关性分析

通过统计学软件SPSS 20.0分析青稞中多酚含量与ORAC的相关性，结果见表4。青稞总多酚含量与ORAC值，决定系数R2为0.997，呈极显著正相关(P<0.01)，同时，各种形态多酚含量与其抗氧化能力指数之间均存在极显著性正相关(P<0.01)，其中游离多酚含量与多酚ORAC值的决定系数最高，R2为0.994，表明青稞多酚含量对其抗氧化能力的大小有重要影响，不同形态青稞多酚对抗氧化能力的贡献有区别[22]。

表4 青稞中游离型、酯化型、结合型多酚含量与抗氧化能力指数的相关性分析†

3 结论

从青稞独立花中提取了游离型、酯化型和结合型3种形态的多酚，分别测定了不同形态多酚含量、酚类单体组成以及抗氧化活性。发现与挤压前的青稞粉相比，总多酚含量显著性下降，其中游离型、结合型多酚含量均下降，酯化型多酚含量增加；不同形态多酚提取物中检测出的多酚单体种类发生改变，阿魏酸是青稞中最丰富的多酚化合物且主要以结合态存在；两种状态下的青稞多酚含量与抗氧化能力呈显著正相关。

挤压膨化在改变青稞口感风味[14]的同时，对青稞中的多酚组分及其抗氧化能力也有显著影响。后续可增加检测的青稞品种数量和多酚化合物种类，深入探究挤压膨化工艺对青稞多酚组成及其抗氧化能力的影响。