伸筋草多糖镇痛功效成分的分离鉴定

田家宝 徐德平

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

伸筋草(LycopodiumjaponicumThunb)为石松科植物石松的干燥全草，民间用于祛风除湿，舒筋活络，关节酸痛，屈伸不利，中老年人常将伸筋草、益智仁、远志混合后泡茶，泡酒，东南沿海地区也常将伸筋草与肉类搭配作为佐料煲汤。现代药理研究[1-3]表明，伸筋草具有镇痛、消炎、调节免疫、清除自由基、参与生物活性的调节等作用。关于伸筋草镇痛作用的报道，国内外目前主要集中在伸筋草粗提物的镇痛作用和伸筋草的化学成分上，如：曾元儿等[4]对伸筋草不同提取部位的药效进行对比研究认为，伸筋草的镇痛功效主要存在于氯仿、正丁醇和水提取部位；李墨娇等[5]对伸筋草的化学成分研究主要集中在三萜类和生物碱上。但关于伸筋草提取物镇痛的具体功效成分未见报道。

试验拟通过小鼠醋酸扭体反应[6]和热板模型[7]，利用水提醇沉[8]和多种层析分离法，筛选和分离伸筋草起镇痛效果的主要组分，以期为其综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

伸筋草：安徽亳州中药市场；

无水葡萄糖、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、冰醋酸等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

Sephacry S-400色谱柱：美国GE Healthcare公司；

硅胶板：GF254，山东烟台芝罘化工厂；

Sephadex G-100色谱柱：瑞典Pharmaeia公司；

AB-8型大孔吸附树脂：天津南开大学化学工厂；

HW-55F色谱柱：日本TOSOH公司；

DEAE-纤维素色谱柱：日本TOSOH公司；

UltrahydrogelTMLinear色谱柱：美国Waters公司；

雌雄ICR小鼠：体重18～22 g，上海斯莱克动物实验有限公司；

试验用水选用去离子水。

1.1.2 主要仪器设备

磨粉机：GLF-205型，浙江省温州市创立药材器械厂；

紫外分光光度计：UV-2450型，日本岛津公司；

萃取罐：RAT-100型，无锡申科仪器有限公司；

恒流泵：SYB106-100型，天津市科器高新技术公司；

暗室紫外投射仪：ZF-90型，上海顾顺电光仪器厂；

色谱仪：GPC型，日本岛津公司；

核磁共振仪：Avance500MHz型，德国Bruke公司；

示差检测器：RID-10A型，日本岛津公司。

1.2 试验方法

1.2.1 伸筋草提取物制备与粗分离 将伸筋草粉碎，经40目分样筛筛分得10 kg伸筋草粉末，与体积分数为70%的乙醇按料液比(m伸筋草粉∶V乙醇)1∶10 (g/mL)混合，置于100 L双层反应釜中提取，反应温度设为65 ℃，匀速搅拌4 h，静置过滤，依上述步骤重复提取2次，减压浓缩[9]所得滤液，即为伸筋草乙醇提取物，将其于-20 ℃冷冻保存。依上述步骤，伸筋草醇提所得滤渣加入去离子水100 L，于反应釜中匀速搅拌4 h，在反应温度65 ℃的条件下重复提取2次，静置3 h后抽滤，取滤液减压浓缩至5 L，合并浓缩液即为伸筋草水提物，4 ℃下冷藏保存。

取适量伸筋草水提物加入3倍无水乙醇，边加边搅拌，静置过夜，重复3次，过滤得醇沉相(A)、醇溶相(B)。于AB-8型大孔树脂柱(10 cm×150 cm)中上适量醇提物，利用梯度洗脱法，以水、40%乙醇、80%乙醇和无水乙醇为洗脱剂顺序洗脱。洗脱过程采用薄层色谱法[10](TLC)检测成分并分为4部分，水洗脱(C)、40%乙醇洗脱(D)、80%乙醇洗脱(E)和无水乙醇洗脱(F)部分。将各组分分别减压浓缩后冷冻保存。

1.2.2 伸筋草粗分组分的镇痛作用

(1) 醋酸扭体测反应发生时间：选取70只4周龄SPF级ICR小鼠，雌雄各半，体重(20±2) g。适应性饲养1周后，随机分为7组，每组10只，雌雄各半。试验组为A、B、C、D、E、F，每日以1.0 g/kg剂量灌胃[11]，空白对照为K，灌同体积的蒸馏水，连续灌胃3 d，试验前12 h禁食不禁水。试验在23～25 ℃下进行，试验组在灌胃给药1 h 后，腹腔注射体积分数0.5%醋酸，注射剂量为0.2 mL/只，试验在注射后开始，10 min内小鼠第一次扭体出现时间记为反应时间，超过10 min以10 min记录。

(2) 热板法测舔足时间：于热板上测定ICR雌性小鼠(18±2) g舔足阈值[12]，小鼠为4周龄SPF级，热板温度(55±5) ℃，舔足阈值应在5～30 s，共选取70只分为7组，每组10只，试验组为A、B、C、D、E、F，连续3 d以每日1.0 g/kg剂量灌胃，去离子水连续3 d以每日1.0 g/kg剂量灌胃，空白对照为K，试验前12 h禁食不禁水。试验在各组小鼠灌胃给药后开始，测定各组小鼠30，45，60 min 的舔足时间，若60 s仍无反应者，将其取出以免烫伤，该鼠以60 s计。

1.2.3 醇沉相活性组分的分离 将含有镇痛功效的醇沉相A组分减压浓缩后，加入适量的去离子水至适宜体积并上样至DEAE柱(5 cm×100 cm)，流速恒定5 mL/min，洗脱液为去离子水和0.05，0.10 mol/L的NaCl溶液，自动收集器收集洗脱液每管10 mL，并采用苯酚硫酸法[13]检测洗脱液成分，将相同组分收集合并得水洗脱G、盐洗脱H。

1.2.4 DEAE柱不同洗脱组分活性的检测 按1.2.2方法对DEAE柱分离得到的G、H两个组分展开动物试验，分析各组镇痛作用。

1.2.5 镇痛活性成分的分离 取40 mL具有镇痛活性的水洗脱组分G，质量浓度为40 mg/mL，去离子水以2 mL/min 洗脱通过HW-55F(3 cm×100 cm)色谱柱，收集洗脱液每管10 mL，采用苯酚硫酸法分析组分，将相同组分合并收集。取40 mL主要组分G1上Sephacry S-400(3 cm×100 cm)凝胶色谱柱，质量浓度为40 mg/mL，去离子水洗脱，流速2 mL/min，苯酚硫酸法跟踪监测组分。

1.2.6 多糖纯度鉴定 多糖P加水配制5 mg/mL溶液，分光光度计于200～400 nm测其吸光光度[14]。于Sephadex G-100 (3 cm×100 cm)色谱柱中通过多糖P溶液，去离子水以2 mL/min速度洗脱，收集洗脱液采用苯酚硫酸法鉴别纯度。

1.2.7 高效凝胶过滤色谱测定分子量 准确称取1 mg多糖P，加入去离子水配制质量浓度为5 mg/mL的多糖P溶液，进样量20 μL，上UltrahydrogelTMLinear(7.8 mm×300 mm)色谱柱测定分子量[15]，流速0.5 mL/min，柱温40 ℃。

1.2.8 多糖P的结构鉴定 取适量多糖P，用重水溶解，进行1H-NMR、13CNMR、13DEPT-NRM光谱数据分析，分析其结构。

2 结果与分析

2.1 伸筋草粗分组分镇痛活性

2.1.1 扭体反应时间 由表1可知，醇溶相B组比空白组扭体反应时间显著延长，镇痛效果显著(P<0.05)。醇沉相A组较空白组，扭体反应时间显著延长，镇痛效果极显著(P<0.01)，且A组较其他组均有显著性差异(P<0.05)，A组中存在具有镇痛功效的成分且能在短时间内迅速镇痛。其他组较空白组无显著差异，对醋酸扭体反应时间无明显延长，无显著镇痛作用。

表1 伸筋草粗分组分对小鼠醋酸扭体反应时间的影响†

2.1.2 热板法测小鼠舔足时间 由表2可知，各给药组中，给药30 min后，A组小鼠舔足时间明显提高，镇痛效果显著(P<0.01)，并且该组在给药45 min后舔足时间提高明显，镇痛效果显著(P<0.05)，而给药60 min后舔足时间略有提高，无显著镇痛效果，说明醇沉相A给药30 min 后镇痛效果最好，随时间的延长镇痛效果减弱。其他组无显著镇痛效果。结合表1、表2可知，醇沉相A较醇溶相B的镇痛效果更好。

2.2 DEAE色谱柱各洗脱组镇痛效果的检测

由图1可知，醇沉相A过DEAE柱，洗脱曲线中出现2个洗脱峰，且只有G是水洗脱物，可确定多糖组分主要存在水洗脱的G组，而NaCl溶液洗脱部分H组含量较少。两组分镇痛效果见表3、表4。由表3可知，在各给药组中发现G组较空白组醋酸扭体反应时间显著延长，有显著镇痛效果(P<0.05)。H组较空白组，醋酸扭体反应时间有一定的延长作用但无显著性差异，无显著镇痛效果。

由表4可知，在各给药组中G组在给药30 min后，舔足时间提高明显，有极显著的镇痛效果(P<0.01)，在给药45 min后舔足时间明显提高，镇痛效果极显著(P<0.01)，在给药60 min后，舔足时间提高明显，镇痛效果显著(P<0.05)。G组在给药30 min后镇痛效果最好，随着时间的延长镇痛效果减弱。其他组无显著镇痛效果。

2.3 伸筋草镇痛活性多糖类的分离

2.3.1 凝胶色谱柱分离结果 G组分经HW-55F凝胶色谱柱进一步分离得到G1、G2组分，所得洗脱曲线如图2所示，将含量极少无法支撑继续分离的G2组分排除，选取含量较大的G1组分进一步分离。G1经Sephacryl S-400凝胶色谱柱多次分离纯化，得多糖P，如图3所示，多糖P有且仅有一对称峰，表明P为均一多糖[16]。

表2 伸筋草粗分组分对小鼠舔足时间的影响†

图1 DEAE纤维素柱洗脱曲线Figure 1 Elution curve of DEAE cellulose column

表3 DEAE洗脱组分对小鼠醋酸扭体反应时间的影响†

表4 DEAE洗脱组分对小鼠舔足时间的影响†

2.3.2 多糖纯度鉴定及其分子量的测定 于260～280 nm 下，紫外吸光光度显示多糖P溶液无吸收峰，可得多糖P不含蛋白质和核酸或含量极低，是单一化合物。经高效凝胶渗透色谱测得多糖P相对分子量为3.24×105Da。

2.3.3 NMR分析 由图4可知，δ4.84，4.78处为端基H信号，由于与重水的峰相互重迭，不能确定H信号的积分，δ1.15处有一个甲基H信号，说明含有甲基，但多糖H信号复杂相互重迭难以进一步确定甲基归属。伸筋草多糖13CNMR如图5所示，该多糖在δ176.3处含有一个羧基，表明为酸性多糖，而在DEAE柱用水洗脱下来应为中性多糖，δ23.1处有一甲基信号，从化学位移看应为乙酰基的甲基，得出该多糖含有乙酰基。δ104.0，101.9，101.4处有3个碳信号，可以判定有3个糖残基存在且都为葡萄糖。从δ104.0，79.5，77.6，73.4，71.3，63.3处的碳信号丰度得出，这些碳信号为主链，并以1→4键相连，δ83.7 处碳信号说明有1→2健存在，从丰度看为侧链，δ67.5 处碳信应为C6信号，由于化学位移向低场移，推断乙酰基连在该位点。异头碳在β构型的化学位移值一般大于103，δ104.0处是多糖P主链C1的化学键位移值，所以可推测为β构型，故该多糖为主链为葡萄糖以1→4键相连，β构型，侧链连在2位上。由图6可知，δ69.7 处的碳为CH2信号，表明C6位向低场移动，可以得出乙酰基连在6位上，具体结构与数量还需进一步研究。

图2 HW-5F凝胶柱洗脱曲线Figure 2 Elution curve of HW-55F gel colum

图3 Sephacryl S-400凝胶柱洗脱曲线Figure 3 Elution curve of Sephacryl S-400 gel column

图4 多糖P 1H-NMR图谱Figure 4 1H-NMR spectrum of polysaccharide P

图5 多糖P 13CNMR图谱Figure 5 13CNMR spectrum of polysaccharide P

图6 多糖P 13DEPT-NRM图谱Figure 6 13DEPT-NRM spectrum of polysaccharide P

3 结论

伸筋草经水提醇沉后，其醇沉相具有显著的镇痛作用，该组分经DEAE柱分离后发现，镇痛功效主要存在于多糖中，对其进一步分离得到1个主要多糖P，通过多糖P的13C-NMR谱分析可以推测多糖P的框架是以(1→4)-β-葡萄糖为主链，存在侧链与酰基，且其侧链连在2号位，乙酰基连在6号位。

有研究[17]认为伸筋草的氯仿与正丁醇提取部分是起镇痛作用的主要部位。试验结果表明，伸筋草多糖是起镇痛作用的主要成分，有着良好的外周镇痛作用和中枢镇痛作用，主要是因为通过热板法和扭体法观察外周镇痛作用和中枢镇痛作用[18]，发现在此次试验中小鼠热板舔足时间显著提高，醋酸扭体发生时间显著延长。免疫器官指数和免疫细胞因子[19]的改善可能是伸筋草多糖具有镇痛功效的主要原因，具体机制还需深入研究。