高效液相色谱法同时测定柚子中的4种黄酮苷和柠檬苦素

张 珊 黄雪松

(暨南大学理工学院，广东 广州 510632)

二氢黄酮类化合物(包括芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷)[1]和三萜内酯化合物柠檬苦素均为柚子中的活性成分，其中柚皮苷和柠檬苦素为苦味物质，前者造成“直接”苦味，后者呈现“后苦”现象[2-3]，两类物质的含量是衡量柚子加工产品质量和保健功效的重要品质指标，因此两类物质的测定方法成为相关领域研究的热点。

但现有标准及报道中，这两类物质都是分别测定的，如：GB 1886.262—2016仅规定了柚皮苷的高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)测定方法；NY/T 2014—2011规定了同时测定橙皮苷、柚皮苷的HPLC方法；朱露等[4]提出同时测定枳实中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的HPLC方法；蔡艳芳等[5]提出测定枳实中柠檬苦素的HPLC方法，迄今尚未见柠檬苦素与黄酮类物质同时测定的报道。试验拟以柚子幼果和柚子果汁为样品，研究一种方便、快速、准确且同时测定芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和柠檬苦素5种成分的HPLC方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白肉蜜柚幼果(直径小于5 cm)、白肉蜜柚：广东顺兴种养股份有限公司；

芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷标准品：成都普菲生物技术有限公司；

柚皮苷标准品：上海麦克林生化科技有限公司；

柠檬苦素标准品：上海源叶生物科技有限公司；

甲醇、乙腈：色谱纯：瑞典欧森巴克化学公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪：LC-20A nence型，配SPD-M20A紫外检测器，岛津(广州)检测技术有限公司；

冷冻干燥机：SCIENTZ-10N型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

二两装高速中药粉碎机：111型，瑞安市永历制药机械有限公司；

高速离心机：HC-3514型，安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准品溶液制备 精确称取一定量的芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷分别用甲醇溶解于50 mL容量瓶中并定容，制成质量浓度分别为1.053，1.363，1.102，1.096 g/L的单标溶液，测定其出峰时间及紫外吸收光谱。

精确称取一定量芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和柠檬苦素，用甲醇溶解于同一50 mL容量瓶中并定容，制成质量浓度分别为1.080，1.146，1.104，1.176，0.812 g/L 的混标母液，用甲醇倍比稀释至0.50，0.25，1.25×10-1，6.25×10-2，3.13×10-2，1.56×10-2，7.81×10-3，3.91×10-3，1.95×10-3，9.77×10-4倍，测定其浓度。

1.3.2 样品制备 精确称取冻干柚子粉末(100目)样品0.107 7 g于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，超声提取30 min，用0.45 μm微孔滤膜过滤，待测。

取新鲜柚子以果肉榨汁，取1 g柚子汁溶于10 mL甲醇，超声提取30 min后，6 000 r/min离心10 min，取上清液，将上清液与甲醇(V上清液∶V甲醇)以1∶50的比例再次混合，静置30 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤后待测。

1.3.3 HPLC梯度洗脱方法 参考朱露等[4]和蔡艳芳等[5]的方法，设计如表1中的5种方法。根据所获HPLC色谱图从中选出最适宜的方法予以评价。

1.3.4 HPLC测定条件 色谱柱Bio-Bond 5 μm C18(4.6 mm×250 mm)；流动相为乙腈(A)和水(B)，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温40 ℃。配二极管阵列紫外检测器(PDA)，分别在283 nm和220 nm检测4种黄酮苷和柠檬苦素。

混标溶液洗脱条件由表1中的5种洗脱方法逐个试用，单标溶液洗脱条件和柚子样品的洗脱条件为表1中选取的最优方法。

1.3.5 重复性的测定 取1.3.2中的供试品溶液，制成平行样品5份，以1.3.4中的HPLC条件进行测定，每份样品连续进样3次，记录峰面积，分别计算5种成分的含量和相对标准偏差(RSD)。

1.3.6 精确度与加样回收率的测定 精密称取201.5 mg柚子幼果粉末，置于50 mL容量瓶中，分别加入不同质量的5种标准品，定容。以1.3.2中的方法处理后，制成平行样品5份，在1.3.4中的HPLC条件下进行测定，每份样品连续进样3次，记录峰面积，按式(1)计算平均回收率。用平均回收率和相对标准偏差(RSD)评价精确度高低。

(1)

式中：

R——回收率，%；

m1——测得量，mg；

m2——样品中成分质量，mg；

m3——加标量，mg。

2 结果与分析

2.1 测定条件的确定

2.1.1 测定波长 图1分别为芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和柠檬苦素的紫外吸收光谱图。由图1(a)～(d)可知，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的最大吸收波长分别为282，282，283，283 nm，为操作与计算方便，选取283 nm为4种黄酮苷的紫外吸收波长。由图1(e)可知，当检测波长<240 nm时，波长越小，柠檬苦素的响应值越大，但考虑到既能检测到柠檬苦素又尽可能减少杂质或溶剂导致的紫外吸收误差，选择220 nm 为测定柠檬苦素的吸收波长。据此，定量测定上述5种成分时，柠檬苦素选择采用220 nm时的吸收峰面积，而4种黄酮则采用283 nm测定时的吸收峰面积。

表1 5种不同的洗脱程序

图2(a)～图2(e)分别为芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和柠檬苦素的单标在方法5的洗脱程序下所获色谱图，图2(f)和图2(g)为上述5种物质的混标在方法5的洗脱程序下所获色谱图。由单标和混标的出峰时间对比分析可知，图2(f)和图2(g)中峰1～5分别为芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和柠檬苦素。

图1 4种黄酮苷和柠檬苦素的紫外吸收光谱图Figure 1 UV absorption spectra of four flavonoid glycosides and limonin

1. 芸香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 柠檬苦素图2 5种标准品在283 nm和220 nm处的色谱图Figure 2 Chromatograms of 5 standards at 283 nm and 220 nm

2.1.2 最佳HPLC梯度洗脱条件 如图3所示，逐步提高流动相中乙腈比例，可使柠檬苦素的出峰时间提前。柠檬苦素出峰时间由方法1中21.15 min提前至方法5中15.84 min[图2(g)]，提前了5.31 min，这是因为C18反相色谱柱的填料以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱的官能团。因此，选择系统洗脱时间最短的方法5测定4种物质；在该条件下，各成分的分离度均大于1.5，满足测定要求[6]。

2.2 测定方法的可靠性

2.2.1 标准曲线、线性范围、检测限和定量限 在1.3.4的条件下，对不同质量浓度的4种黄酮苷与柠檬苦素标准品进行测定。以各组分的峰面积为纵坐标(y)，对应质量浓度为横坐标(x)绘制标准曲线，得到5种物质的线性方程(见表2)。信噪比(S/N)为3时所对应的质量浓度即为检出限(LOD)，信噪比为10时对应的质量浓度为定量下限(LOQ)[7]。

2.2.2 重复性 按照1.3.5的处理方法，得出表3的重复性进样结果，其相对标准偏差(RSD)均小于2%，表明此种方法重复性良好。

2.2.3 精确度与加样回收率 按照1.3.6的处理方法，得出表4中一系列结果，5种成分的平均回收率范围为98.47%～99.81%，RSD均小于2%，表明此种方法测量精确，回收率良好。

2.3 柚子幼果与柚子汁中5种物质的含量

根据上述测定方法与标准曲线，测定按照1.3.5准备的柚子样品，测得柚子幼果(图4)中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和柠檬苦素的质量分数分别为8.49%，8.05%，1.30%，1.31%，1.46%；测得柚子汁(图5)中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和柠檬苦素的质量分数分别为1.41%，2.63%，0.23%，0.16%，0.78%。

1. 芸香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 柠檬苦素图3 不同洗脱条件下的色谱图(220 nm)Figure 3 Comparison of tailing of limonoid peaks under different elution conditions (220 nm)

表2 5种成分的标准曲线、相关系数、线性范围、检出限、定量限†

由图4、图5可知：4种黄酮物质分离度高，峰型好；但柠檬苦素峰型受到样品中杂质的影响，有一定的偏差，需要注意选择积分曲线；由表5可知：不同品种、不同生长期和不同部位的柑橘作物中成分质量分数各不相同。

尽管如此，通过上述方法一次测定且同时获得上述5种成分的含量是非常方便的。此前，人们或分为2～3次分别测量5种物质，或仅测其中的3～4种，试验所建立的HPLC方法可方便地同时测得其含量，为测定柑橘水果中类黄酮和苦味物质节约大量的成本与时间。

表3 5种成分的重复进样结果

表4 5种成分的加样回收率†

1. 芸香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 柠檬苦素图4 柚子幼果在283 nm和220 nm处的色谱图Figure 4 Chromatograms of young pomelo sample solution at 220 nm and 283 nm

1. 芸香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 柠檬苦素图5 柚子汁在283 nm和220 nm处的色谱图Figure 5 Chromatograms of young pomelo sample solution at 283 nm and 220 nm

表5 不同柚子品种与部位的5种成分质量分数

3 结论

试验建立的高效液相色谱法在20 min内，利用PDA检测器在283 nm与220 nm分别完成了对柚子幼果及柚子果汁中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和柠檬苦素5种关键的黄酮类和苦味物质的同时定量测定，测得柚子幼果中5种成分的质量分数分别为8.49%，8.05%，1.30%，1.31%，1.46%，柚子果汁中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和柠檬苦素的质量分数分别为1.41%，2.63%，0.23%，0.16%，0.78%。但最终确定的方法中，新橙皮苷与柠檬苦素峰[图2(g)]之间的时间间隔仍然较长，后续可使用不同流动相组分或洗脱方法予以减少。